吳淑芳 曾克非 蘆 珊

TAB3(TAK1-binding protein 3)是的 TGF-β 激活激酶 1(TAK1)的1個新的結(jié)合蛋白，參與了多個生理過程，Jin 等發(fā)現(xiàn) TAB3 在結(jié)腸癌、肺癌中的表達(dá)明顯高于其對應(yīng)的癌旁組織[1-3]。

CCAAT增強(qiáng)結(jié)合子蛋白δ (CCAAT enhancer binding protein C/EBPδ，CEBPD) 屬于CCAAT增強(qiáng)結(jié)合子蛋白家族的一員。最近研究報道CEBPD是1個抑癌基因，在乳腺癌中，Src激酶下調(diào)CEBPD表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖[4-6]，但是CEBPD在卵巢癌中的表達(dá)及其與TAB3表達(dá)的關(guān)聯(lián)還不清楚。為此，我們收集51例原發(fā)性卵巢癌組織和對應(yīng)的癌旁組織，通過實時熒光定量PCR、Western blot檢測卵巢癌組織和對應(yīng)的癌旁組織中TAB3和CEBPD的表達(dá)情況，并分析兩者表達(dá)是否存在相關(guān)性。此外，通過實時熒光定量PCR、Western blot檢測正常卵巢細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞系中TAB3和CEBPD的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)江西省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批及患者知情同意后，收集51例江西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科手術(shù)切取的卵巢癌組織及癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均由病理確診，術(shù)前均未接受化療及放療。所有標(biāo)本均由資深病理專家確診。正常卵巢細(xì)胞株2IOSE80和卵巢癌細(xì)胞株HO-8910、SK-OV-3、OVCAR-3、COC1、Caov-4、ES-2購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

兔抗人TAB3蛋白多克隆抗體(proteintech公司)，使用濃度1∶100，兔抗人CEBPD蛋白多克隆抗體(Abcam公司)，使用濃度1∶1000；帶辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗體，使用濃度1∶10000(中杉金橋)；蛋白Marker 26616、天根超敏發(fā)光試劑盒、5×SDS上樣緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天公司)、蛋白抽提試劑盒(北京普利來公司)、蛋白印跡膜再生液(北京普利來公司)、細(xì)胞蛋白裂解液(北京普利來公司)；甘氨酸(Glycine)，SDS、氯化鈉(NaCl)，溴化乙錠(EB)，瓊脂糖(北京索萊寶科技有限公司)；氯仿，甲醇，乙醇，異丙醇、硼酸(上海化工有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Western blot 首先總蛋白提取，然后BCA法蛋白濃度測定，接下來進(jìn)行SDS-PAGE電泳，接著轉(zhuǎn)膜和進(jìn)行免疫反應(yīng)，最后凝膠圖像分析和PVDF膜再生。

1.3.2 qRT-PCR 首先RNA提取，接下來逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,最后采用SYBR Green法，在ABI PRISM 7500自動熒光PCR儀上進(jìn)行，將cDNA稀釋品分別梯度稀釋,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s 58 ℃ 30 s 72 ℃ 30 s共45個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

增加溶解曲線。閾值定義為循環(huán)數(shù)為Ct，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算目的基因TAB3、CEBPD和GAPDH的mRNA量，每個樣品TAB3、CEBPD與GAPDH基因濃度比值，即為校正后的相對含量。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 檢測卵巢組織中TAB3與CEBPD的表達(dá)情況

通過qQRT-PCR及western blot方法檢測卵巢癌組織及對應(yīng)的癌旁組織中TAB3和CEBPD的表達(dá)情況。熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中TAB3 mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.001)，而卵巢癌組織中CEBPD mRNA的表達(dá)明顯低于癌旁組織(P<0.05)，見圖1A；同樣，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAB3蛋白在 62.74%(32/51)的卵巢癌組織中呈過表達(dá)，CEBPD蛋白在60.78%(31/51) 的卵巢癌組織中呈低表達(dá)(P<0.05),見圖1B、C。上述結(jié)果說明在卵巢癌組織中TAB3基因的表達(dá)明顯升高，而CEBPD基因的表達(dá)明顯下降。

A：qRT-PCR檢測51例卵巢癌患者的癌組織和對應(yīng)癌旁組織中TAB3 及CEBPD mRNA的表達(dá)情況；B-C：Western blot 分析在卵巢癌組織和對應(yīng)癌旁組織中TAB3和CEBPD蛋白的表達(dá)(部分典型病例)，其中T代表癌組織，N代表癌旁組織。

2.2 TAB3和CEBPD基因在卵巢癌組織中表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

我們進(jìn)一步分析TAB3和CEBPD基因在卵巢癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，散點圖結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中TAB3和CEBPD的mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(γ=-0.2853，P<0.05)，見圖2A。此外，在卵巢癌組織中TAB3和CEBPD蛋白表達(dá)也同樣呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性(γ=-0.3091，P<0.05)，見圖2B。

圖2 TAB3與CEBPD mRNA和蛋白的相關(guān)性

2.3 卵巢細(xì)胞IOSE80和卵巢癌細(xì)胞株中TAB3和CEBPD的表達(dá)情況

通過qRT-PCR檢測正常卵巢細(xì)胞株IOSE80和卵巢癌細(xì)胞株 HO-8910、SK-OV-3、OVCAR-3、COC1、Caov-4、ES-2中TAB3和CEBPD mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞株中的TAB3 mRNA表達(dá)明顯高于正常卵巢細(xì)胞株IOSE80，CEBPD mRNA表達(dá)明顯低于正常卵巢細(xì)胞株，見圖3A。同時，我們利用Western blot檢查正常卵巢細(xì)胞株IOSE80和卵巢癌細(xì)胞株HO-8910、SK-OV-3、OVCAR-3、COC1、Caov-4、ES-2中TAB3和CEBPD蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞中TAB3蛋白的表達(dá)比正常卵巢細(xì)胞株IOSE80高， 而CEBPD蛋白表達(dá)比正常卵巢細(xì)胞株IOSE80低，見圖3B。

圖3 正常卵巢細(xì)胞IOSE80和卵巢癌細(xì)胞株中TAB3及CEBPD基因和蛋白的表達(dá)情況

3 討論

研究報道TAB3在許多惡性腫瘤，如肺癌、乳腺癌及食管癌中發(fā)現(xiàn)過高表達(dá)，而且TAB3途徑被認(rèn)為可以作為癌癥的靶向治療[2-3,5]。研究已經(jīng)證實TAB3的表達(dá)與卵巢癌的衛(wèi)星灶形成密切相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)降低卵巢癌細(xì)胞中TAB3的表達(dá)，可以明顯抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。我們研究也發(fā)現(xiàn)TAB3在卵巢癌組織中過表達(dá)，過表達(dá)TAB3可導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯增加。綜上，TAB3在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。

CCAAT增強(qiáng)結(jié)合子蛋白δ (CCAAT enhancer binding protein C/EBPδ，CEBPD) 屬于CCAAT增強(qiáng)結(jié)合子蛋白家族的一員，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)活性，其中包括細(xì)胞分化、生長、增殖和細(xì)胞凋亡[4]。最近研究報道CEBPD是1個抑癌基因，其在腫瘤的增殖過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)CEBPD在乳腺癌、神母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中呈低表達(dá)，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡密切相關(guān)。在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中過表達(dá)CEBPD可以促進(jìn)P28的蛋白表達(dá)，從而抑制白血病細(xì)胞增殖[6-7]。

本實驗通過實時熒光定量和Western blot 檢查卵巢癌組織中的TAB3和CEBPD的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在卵巢癌組織中TAB3呈現(xiàn)高表達(dá)，同時，我們的實驗也發(fā)現(xiàn)CEBPD在卵巢癌組織中低表達(dá)，我們進(jìn)一步通過散點圖分析發(fā)現(xiàn)TAB3和CEBPD在卵巢癌組織中表達(dá)存在負(fù)相關(guān)性。另外，我們通過熒光定量PCR及Western blot檢測了一株正常卵巢細(xì)胞株IOSE80和卵巢癌細(xì)胞 HO-8910、SK-OV-3、OVCAR-3、COC1、Caov-4、ES-2中TAB3和CEBPD的mRNA和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞株中TAB3表達(dá)情況明顯高于正常細(xì)胞株IOSE80，而CEBPD表達(dá)情況明顯低于正常細(xì)胞株IOSE80，且兩者表達(dá)趨勢呈負(fù)相關(guān)。綜上所述，在卵巢癌組織及細(xì)胞中TAB3與CEBPD的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且TAB3和CEBPD均與卵巢癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。因此我們推測在卵巢癌中TAB3可能通過調(diào)控CEBPD的表達(dá)而影響細(xì)胞的增殖，然而其具體調(diào)控機(jī)制有待我們進(jìn)一步去探討。