王艷云 高明敏 姚 麗 張永紅

惡性黑色素瘤是惡性程度極高的皮膚惡性腫瘤[1-3]，具有高死亡率，而且侵襲性也較高，是目前引起男性死亡的第5大惡性腫瘤，是引起女性死亡的第6大惡性腫瘤，其發(fā)病機制較為復雜，目前仍然未完全研究清楚。中藥雷公藤為衛(wèi)矛科，雷公藤屬木質滕本植物，從中分離提取的有效物質已達數(shù)百種，如雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤多甙等，已經(jīng)研究證實具有抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[4-6]。雷公藤甲素是中藥雷公藤中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內酯化合物，也是雷公藤抗腫瘤藥效的主要成分。上皮-間質轉化(EMT)是指有極性的上皮細胞轉化為具有移行能力的間質細胞的過程，在轉化過程中細胞獲得了侵襲和轉移能力，研究顯示[7-8]，EMT通路是惡性腫瘤侵襲和轉移的途徑之一。為此，本研究對雷公藤甲素對惡性黑色素瘤A375細胞EMT通路及侵襲相關蛋白表達的影響進行了研究，現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人惡性黑色素瘤細胞株A375細胞來源于北京中科院科研中心，雷公藤甲素來源于上海源葉生物科技有限公司，CCK-8來源于美國 Sigma公司，人抗鼠波形蛋白(Vimentin)抗體來源于美國 Santa Cruz公司，兔抗人缺氧誘導因子(HIF-1α)抗體、N-鈣黏素(N-cadherin)抗體來源于美國 CST 公司，胰蛋白酶來源于美國 Hyclone 公司，Matrigel 基質膠來源于美國 BD 公司，Transwell 小室來源于美國Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法 將冷凍儲存的A375細胞復蘇后置于含有10%FBS的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，5%CO2的恒溫細胞孵育箱內孵育培養(yǎng)。每間隔24h換培養(yǎng)液1次，在顯微鏡下觀察到培養(yǎng)的細胞已在培養(yǎng)基內布滿80%面積后加入0.25%胰蛋白酶消化，后在離心機內以3 000 r/min轉速、4 ℃溫度條件下離心，然后按照1∶2進行傳代培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，本研究所培養(yǎng)細胞均為對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 A375細胞增殖狀態(tài) 采用 CCK-8 法檢測A375細胞增殖狀態(tài)。將培養(yǎng)好的A375細胞接種于96孔板，5 000個/孔，培養(yǎng)12 h后觀察到細胞貼壁，取0 mg/l、20 mg/l、40mg/l、60 mg/l濃度的雷公藤甲素母液分別加入上述培養(yǎng)孔板，每組5個復孔，分別對應空白對照組、20 mg/l組、40 mg/l組、60 mg/l組，然后在溫度37 ℃，5%CO2的恒溫細胞孵育箱內繼續(xù)孵育培養(yǎng)24 h，再每孔加入濃度為5 g/l、20 μl劑量的CCK-8，再孵育4 h，吸除掉培養(yǎng)液，再加入150 μl的 DMSO，震蕩10 min，促使晶體充分溶解，然后用波長為570的酶聯(lián)儀對每孔的吸光度值(OD)進行測定，計算出細胞生長抑制率。

1.2.3 A375細胞侵襲能力的測定方法 采取細胞侵襲實驗檢測，Matrigel細胞依據(jù)雷公藤甲素濃度進行分組，Matrigel細胞在4 ℃下過夜，用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋并后包被Transwell上室，成膠體，然后加入培養(yǎng)的A375細胞于上室，在下室內加入5%的血清培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h，然后將未穿透微孔濾膜的細胞用無菌棉簽擦試干凈，固定，結晶紫染色，蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察遷移細胞數(shù)并且計數(shù)。

1.2.4 EMT通路及侵襲相關蛋白表達 以Western Blot方法檢測EMT相關蛋白水平。A375細胞根據(jù)前述方法培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)之貼壁，吸除培養(yǎng)液，并且加入上述不同濃度的雷公藤甲素液，每組為6孔，在培養(yǎng)24 h后取出并且PBS清洗3遍，再加入細胞裂解液，后進行離心處理，以BCA法計算蛋白濃度，然后加入6×Loading buffer 上樣緩沖液沸水煮沸5 min 變性，取提取的蛋白用 SDS-PAGE凝膠進行分離和轉膜、溫室封閉等處理，最后加入目標一抗蛋白，在4 ℃下孵育過夜，隔日進行TBST洗膜后加入目標蛋白二抗然后在25 ℃下孵育1 h，再次TBST洗膜，最后ECL法顯影后對目標蛋白表達水平以內參蛋白β-actin標準化后得到相對比值。采用 Image Lab 軟件測定分析表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同濃度雷公藤甲素對A375細胞增殖能力的影響

不同濃度的雷公藤甲素對A375細胞進行處理后細胞存活率明顯不同，比較差異有統(tǒng)計學意義(F=73.492，P<0.05)。雷公藤甲素對A375細胞的增殖能力在20 mg/l時已經(jīng)出現(xiàn)抑制，因此后續(xù)實驗均選擇此濃度，隨著雷公藤甲素濃度增加細胞存活率明顯下降，雷公藤甲素對A375細胞增殖的抑制具有濃度依賴性，見表1。

2.2 不同濃度雷公藤甲素對A375細胞侵襲能力的影響

不同濃度的雷公藤甲素對A375細胞進行處理后侵襲細胞數(shù)量明顯不同，比較差異有統(tǒng)計學意義(F=185.86，P<0.05)。隨著雷公藤甲素濃度增加侵襲細胞數(shù)量隨之下降，雷公藤甲素對A375細胞侵襲能力的抑制具有濃度依賴性，見表1。

表1 不同濃度雷公藤甲素對A375細胞存活率、侵襲能力的影響

2.3 不同濃度雷公藤甲素對A375細胞HIF-1α及EMT通路相關侵襲蛋白表達的影響

不同濃度的雷公藤甲素對A375細胞進行處理后HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=32.19、24.88、52.49，P均<0.05)。隨著雷公藤甲素濃度的增加，HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達量隨之下降，見表2。

表2 不同濃度雷公藤甲素對A375細胞HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達的影響

3 討論

惡性腫瘤的侵襲和轉移是導致患者病情不斷進展的主要原因，EMT信號通路是惡性腫瘤侵襲和轉移的途徑之一[7-8]，在此過程中上皮細胞向間質轉化，引起細胞基因和形態(tài)的改變，EMT信號通路主要包括撕裂原活化蛋白激酶信號通路、轉化生長因子β信號通路、Wnt/beta-catnin信號通路、NF-kB信號通路、Notch信號通路等[7-10]。腫瘤的低氧或者缺氧環(huán)境有助于大多數(shù)惡性腫瘤細胞的增殖和侵襲，HIF-1α是EMT信號通路的主要調控因子，通過結合缺氧反應元件調控靶基因的合成，最終影響到細胞的凋亡、轉移和侵襲等多個方面[11-13]。惡性腫瘤患者往往表現(xiàn)為HIF-1α的表達上調，同時，HIF-1α也能作為患者預后及病情嚴重程度的評價指標。Vimentin、N-cadherin均為EMT信號通路相關蛋白，Vimentin基因位于染色體的10p13，屬于Ⅲ型中間纖維蛋白，Vimentin是EMT信號通路中的主要標志物，EMT發(fā)生時Vimentin會出現(xiàn)高度表達，Vimentin在惡性腫瘤的轉移、侵襲中均有重要意義，同時相關研究顯示Vimentin的表達下調后能抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[14-16]。N-cadherin是依靠結合鈣離子粘附糖蛋白，屬于間質標志物，主要在內皮細胞和神經(jīng)等間質組織中分布，能調節(jié)鈣離子介導的細胞間的粘附、細胞形態(tài)的維持和極性、細胞的遷移及識別等，在EMT信號通路中與Vimentin的作用相似，能介導腫瘤細胞從上皮細胞向間質細胞轉化，促使血管生成、腫瘤侵襲和遷移[17-19]。

惡性黑色素瘤是皮膚惡性腫瘤，近年來惡性黑色素瘤的發(fā)病率逐年升高，治療主要以手術切除為主，輔助以放化療等其他措施，但是患者生存率仍然較低。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的快速發(fā)展，中藥在惡性腫瘤的治療中越來越受到重視，而且大量的研究顯示[20-22]，中藥很多有抗炎、抗腫瘤、改善免疫功能等作用。中藥雷公藤也被應用在惡性黑色素瘤患者的治療中。研究顯示，雷公藤甲素具有抗炎、抗腫瘤、免疫調節(jié)、抗菌等功效，在治療惡性腫瘤時能與化療藥物共同作用起到殺傷腫瘤細胞的作用，同時還能抑制腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，其抗腫瘤時可通過抑制腫瘤細胞增殖、降低細胞侵襲和轉移能力、誘導細胞凋亡等多種途徑發(fā)揮作用[16,22-24]。

本研究對雷公藤甲素對惡性黑色素瘤A375細胞EMT通路及侵襲相關蛋白表達的影響進行了研究，對惡性黑色素瘤A375細胞進行體外培養(yǎng)，加入雷公藤甲素對A375細胞的增殖、侵襲能力等進行了實驗研究，結果顯示雷公藤甲素在體外不僅能抑制A375細胞的增殖，還同時能抑制其侵襲能力，同時觀察到隨著雷公藤甲素濃度增加細胞存活率、侵襲細胞數(shù)量明顯下降，表明雷公藤甲素對A375細胞增殖和侵襲能力的抑制具有濃度依賴性，雷公藤甲素抑制A375細胞的增殖和侵襲能力是肯定的。同時，觀察不同濃度的雷公藤甲素對A375細胞進行處理后HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達量，隨著雷公藤甲素濃度的增加，HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表達量隨之下降，推測明雷公藤甲素可能主要是通過抑制EMT信號通路及其相關蛋白的表達進而起到抑制腫瘤細胞增殖和侵襲的作用，但是在此途徑中有無其他途徑共同作用，尚需要進行其他實驗進一步深入研究。

綜上所述，雷公藤甲素能抑制惡性黑色素瘤A375細胞中HIF-1α及Vimentin、N-cadherin表達，通過抑制EMT通路抑制惡性黑色素瘤細胞的增殖及侵襲，且雷公藤甲素對惡性黑色素瘤A375細胞的增殖和侵襲抑制具有濃度依賴性，但是由于雷公藤甲素也有一定毒副作用，因此尚需要后期進一步研究其抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲的最佳濃度，為日后臨床應用雷公藤甲素治療惡性黑色素瘤提供更為安全有效的依據(jù)。