陸曉東 姚安軍 李靜云 陳凌子 唐志苗 金霞云

食管癌是最常見的癌癥之一，其死亡率居全球惡性腫瘤的第6位[1]。食管鱗狀細(xì)胞癌是食管癌的主要病理類型，占食管癌病例的90%以上[2]。盡管手術(shù)治療、放射治療及化學(xué)治療在食管鱗狀細(xì)胞癌治療方面取得較大進(jìn)展，但食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率和病死率依舊較高。因此，深入研究食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重要的臨床意義。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度為21～24個(gè)核苷酸，具有高度保守性，參與調(diào)控癌細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。近年來大量文獻(xiàn)表明，miRNA的異常表達(dá)參與食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)程，如miRNA-134[4]、miRNA-34a[5]、miRNA-216a-5p[6]和 miRNA-204-5p[7]等，而miRNA-4429在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用尚鮮見報(bào)道。基于此，本研究探討miRNA-4429靶向結(jié)合髓樣細(xì)胞白血病-1（MCL1）對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移與侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株（TE-13、KYSE140、EC9706、KYSE30）、293T 細(xì)胞株和人食管正常上皮細(xì)胞株Het-1A均購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640 培養(yǎng)基（批號(hào)：21870084）、FBS（批號(hào)：10091148）和 DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：11995065）均購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；模擬物對(duì)照（mimics NC）和miRNA-4429模擬物（miRNA-4429 mimics）均購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)：11668019）購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；Trizol試劑（批號(hào)：R401-01）、凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A211-01）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：MR101-01）和qRT-PCR試劑盒（批號(hào)：MQ101-01）均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；Transwell小室（批號(hào)：3422）和Matrigel基質(zhì)膠（批號(hào)：354248）均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；CCK-8試劑盒（批號(hào)：C0037）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；TBST緩沖液（批號(hào)：T1085）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MCL1抗體（批號(hào)：94296）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。Multuskan Go 1510酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；QTOWER 2.2熒光定量PCR儀購(gòu)自德國(guó)analytikjena公司；奧林巴斯x71顯微鏡購(gòu)自上海無陌光學(xué)儀器有限公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)Tanon-5200Multi購(gòu)自上海天能科技有限公司；CytoFLEX S型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將EC9706細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)將培養(yǎng)液更換為無FBS培養(yǎng)液。按LipofectamineTM2000說明書，分別將miRNA-4429 mimics、mimics NC與脂質(zhì)體試劑混合均勻并靜置20 min后，轉(zhuǎn)染至EC9706細(xì)胞，并分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，轉(zhuǎn)染4～6 h后，更換為正常的完全培養(yǎng)基。次日收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組miRNA-4429相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miRNA-4429相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用qRT-PCR法。收集細(xì)胞后加入1 ml Trizol，按照Trizol說明書進(jìn)行總RNA的提取。所有樣本均取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miRNA-4429上游引物為5'-CGCGAAAAGCTGGGCTGA-3'，下游引物為 5'-AGTGCAGGGTC－CGAGGTATT-3'；U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。以 U6 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 miRNA-4429相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。收集轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞，計(jì)數(shù)后每孔以2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置9個(gè)復(fù)孔，每隔24 h在固定時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μl CCK-8反應(yīng)液于37℃孵育4 h，通過多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的吸光度（OD）值，測(cè)定時(shí)間點(diǎn)分別為24、48、72和96 h，繪制增殖曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞克隆能力檢測(cè) 采用集落形成實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞，計(jì)數(shù)后每孔以500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每48 h更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周后棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗滌并干燥后拍照，在顯微鏡下計(jì)數(shù)并分析集落形成數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞，終止消化后收集 5×105個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min、4 ℃離心 5 min，棄上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，1 000 r/min、4℃離心 5 min，棄上清液。加入 100 μl 1×Binding Buffer，輕輕吹勻至單細(xì)胞懸液。加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI Staining Solution，輕輕吹勻；避光、室溫 20～25 ℃孵育 10 min；加入 400 μl 1×Binding Buffer，輕輕混勻。染色后樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.7 細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞，經(jīng)過離心后采用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)后，稀釋成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl鋪板于Transwell上室，下室加入700 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，采用4%多聚甲醛固定15 min后，用棉簽將上室未遷移的細(xì)胞擦拭干凈，結(jié)晶紫染色1 h，PBS洗滌后，顯微鏡下拍照并計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)則需要提前將基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell上室并置于培養(yǎng)箱過夜成膜，后續(xù)操作按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟，顯微鏡下拍照并計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.8 miRNA-4429靶基因預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 采用miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、miRDB（http://mirdb.org/miRDB/）和 miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/search.php/）在線預(yù)測(cè)miRNA-4429靶基因。采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA-4429是否靶向結(jié)合MCL1。將野生型或突變型（突變MCL1與miRNA-4429結(jié)合位點(diǎn)）的MCL1 3'非編碼區(qū)（3'UTR）片段分別插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pMIR-REPORT Luciferase），內(nèi)參為 β-gal質(zhì)粒（pMIR-REPORT β-gal control plasmid）。將 293T 細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前每孔用PBS洗一遍，并將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM培養(yǎng)基，每孔400 μl；將0.8 μg質(zhì)粒（0.5 μg相應(yīng)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和 0.3 μg β-gal內(nèi)參質(zhì)粒）加入50 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，LipofectamineTM2000加入50 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，靜置5 min后兩者輕輕混勻，再靜置20 min之后加入24孔板中。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4～6 h后，將Opti-MEM換成含有2%FBS的培養(yǎng)基，每孔 400 μl，將15 pmol miRNA-4429模擬物或陰性對(duì)照加入50 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基中，LipofectamineTM2000加入 50 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，靜置5 min后兩者輕輕混勻，再靜置20 min之后加入24孔板中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞裂解液，進(jìn)行Luciferase和β-gal的測(cè)定，計(jì)算熒光素酶相對(duì)活性。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.9 MCL1蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。收集轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EC9706細(xì)胞，用PBS洗滌兩遍后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液用于總蛋白的提取，采用BCA試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度。每組取40 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。TBST溶液洗膜2～3次后，加入MCL1 抗體（1∶1 000）或 GAPDH 抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜2～3次后，加入過氧化物酶標(biāo)記的抗兔或過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠的二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST溶液洗膜2～3次后，加入顯影液顯影。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-4429相對(duì)表達(dá)量比較 4株食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中miRNA-4429相對(duì)表達(dá)量均明顯低于食管正常上皮細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。而與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中miRNA-4429相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01），見表2。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞與食管正常上皮細(xì)胞中miRNA-4429相對(duì)表達(dá)量比較

表2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞miRNA-4429相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 兩組細(xì)胞增殖和克隆能力比較 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值在72、96 h均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1a。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落形成數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1b、表3。

表3 兩組細(xì)胞集落形成數(shù)比較（個(gè)/視野）

圖1 兩組細(xì)胞增殖和克隆能力比較（a：兩組細(xì)胞增殖能力比較；b：兩組細(xì)胞克隆形成能力比較）

2.3 兩組細(xì)胞凋亡率比較 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2、表4。

表4 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)中EC9706細(xì)胞凋亡率的比較

圖2 兩組細(xì)胞凋亡情況的比較

2.4 兩組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)及侵襲數(shù)均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖3（插頁）、表5。

表5 兩組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)比較（個(gè)/視野）

2.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果及兩組MCL1蛋白表達(dá)水平比較 miR-4429與MCL1的3'UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)見圖4a。共轉(zhuǎn)染MCL1 3'UTR-野生型熒光素酶報(bào)告載體后，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組熒光素酶相對(duì)活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而共轉(zhuǎn)染MCL1 3'UTR-突變型熒光素酶報(bào)告載體后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組熒光素酶相對(duì)活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4b。實(shí)驗(yàn)組MCL1蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖 4c。

3 討論

食管鱗狀細(xì)胞癌是人類最致命的惡性腫瘤之一，具有轉(zhuǎn)移快、治療難和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)[8]。在中國(guó)，食管鱗狀細(xì)胞癌占據(jù)食管癌病例的90%以上[9]。研究食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)潛在機(jī)制對(duì)于提高患者的總體生存率是非常必要的。據(jù)報(bào)道，miRNAs在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和分化等生物學(xué)過程中均起著重要的調(diào)控作用。研究表明miRNA-4429在卵巢癌[10]、胃癌[11]、宮頸癌[12-14]、腦膠質(zhì)瘤[15]、結(jié)直腸癌[16]、子宮內(nèi)膜癌[17]、甲狀腺乳頭狀癌[18]和腎透明細(xì)胞癌[19]中均呈低表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，并起到抑癌的作用。目前關(guān)于miRNA-4429是否參與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的研究尚鮮見報(bào)道。

本研究對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株（TE-13、KYSE140、EC9706、KYSE30）和食管正常上皮細(xì)胞株Het-1A中miRNA-4429相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-4429在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中呈低表達(dá)，提示miRNA-4429可能在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用。為進(jìn)一步探索miRNA-4429在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究對(duì)EC9706細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染miRNA-4429 mimics。CCK-8、集落形成實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組EC9706細(xì)胞的體外增殖能力顯著抑制，克隆形成數(shù)目降低，遷移和侵襲能力降低。凋亡調(diào)控的失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要過程，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EC9706細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-4429過表達(dá)可通過促進(jìn)凋亡進(jìn)而抑制EC9706細(xì)胞的增殖能力。一項(xiàng)關(guān)于腦膠質(zhì)瘤的研究也發(fā)現(xiàn)miRNA-4429抑制劑可顯著抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[15]。以上結(jié)果均表明miRNA-4429的異常表達(dá)可能參與食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)程。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可直接互補(bǔ)結(jié)合下游靶基因的3'UTR，干擾靶基因的表達(dá)。本研究通過miRWalk、miRDB和miRTarBase預(yù)測(cè)miRNA-4429可能結(jié)合的靶基因，發(fā)現(xiàn)MCL1可能是miRNA-4429的作用靶基因。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染MCL1 3'UTR-野生型熒光素酶報(bào)告載體后，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組熒光素酶相對(duì)活性降低；而共轉(zhuǎn)染MCL1 3'UTR-突變型熒光素酶報(bào)告載體后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組熒光素酶相對(duì)活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miRNA-4429可靶向結(jié)合MCL1。MCL1基因是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，也是近年來促癌基因研究的熱點(diǎn)之一。MCL1在胃癌[20]、卵巢癌[21]、宮頸癌[22]以及食管鱗狀細(xì)胞癌[23]等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中起促進(jìn)作用，扮演著促癌基因的角色。本研究結(jié)果表明上調(diào)miRNA-4429表達(dá)水平可顯著抑制MCL1的蛋白表達(dá)，說明miRNA-4429可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)節(jié)MCL1的表達(dá)，進(jìn)而抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展。

綜上所述，miRNA-4429在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miRNA-4429的表達(dá)可抑制EC9706細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，提高EC9706細(xì)胞凋亡率，具體的作用機(jī)制可能為miRNA-4429靶向結(jié)合并降低MCL1的表達(dá)，從而干擾MCL1的促癌作用。本研究提示，miRNA-4429可能為食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展的潛在預(yù)測(cè)分子和治療靶點(diǎn)。