倪紅 鄭卜真 王恩 柯紹發(fā) 馬傳花 王皖芬 羅莎

癲癇是一組以大腦神經(jīng)元異常放電所引起的短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病。臨床治療時(shí)，常用的傳統(tǒng)抗癲癇藥物作用有限，約40%的癲癇發(fā)作不能得到有效控制，且長期服藥會(huì)導(dǎo)致患者認(rèn)知功能減退。尤其癲癇患者中兒童比例高，處于大腦發(fā)育期的患兒長期服藥對智力所造成的影響遠(yuǎn)超成人患者。谷氨酸是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)最重要的興奮性遞質(zhì)，參與癲癇發(fā)生、學(xué)習(xí)、藥物依賴成癮、記憶及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等多種病理生理過程。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體，是中樞離子型谷氨酸受體。Pannx1是Pannx家族中唯一被證明可以形成功能通道的成員，在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)[1-6]。Thompson等[7]研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體激活后繼發(fā)的內(nèi)向電流系Pannx 1通道開放所致，Pannx1通道可能在癲癇異常電活動(dòng)中扮演重要角色，阻斷Pannx1通道能抑制癲癇發(fā)作。本實(shí)驗(yàn)通過研究急性癲癇小鼠海馬谷氨酸能神經(jīng)元的電生理變化及使用Pannx1通道阻滯劑干預(yù)后的電生理變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇、建模及癲癇發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇 健康C57 Thy1-YFP小鼠45只，出生后 15～17 d，體重（15.0±0.5）g，雄性 24 只，雌性 21只，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審查，全程遵守實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物管理?xiàng)l例。將小鼠隨機(jī)分為癲癇組、Pannx1組和對照組，各15只。

1.1.2 建模 癲癇組、Pannx1組小鼠腹腔注射東莨菪堿注射液3 ml/kg，30 min后腹腔注射匹魯卡品注射液15 ml/kg，誘發(fā)V級癲癇發(fā)作持續(xù)1 h為建模成功，注射后未誘發(fā)Ⅲ級以上癲癇發(fā)作，可重復(fù)給予原劑量匹魯卡品，以5次為最高限。Pannx1組在建模前1 h腹腔注射甲氟喹溶液20 ml/kg[8]；癲癇組和對照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液20 ml/kg。

1.1.3 癲癇發(fā)作分級 采用小鼠癇性發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)（Racine標(biāo)準(zhǔn)）：0級：無面部陣攣，Ⅰ級：面部陣攣，Ⅱ級：Ⅰ級+節(jié)律點(diǎn)頭，Ⅲ級：Ⅱ級+前肢陣攣，Ⅳ級：Ⅲ級+后肢站立，V級：Ⅳ級+跌倒。

1.2 方法

1.2.1 腦片制備 小鼠癲癇發(fā)作持續(xù)10 min后腹腔注射2%的戊巴比妥注射液0.1 ml進(jìn)行麻醉，斷頭取腦，在充分氧合的冰水混合人工腦脊液中切厚度400 μm的腦片，將其孵育在25℃充分氧和的人工腦脊液[9]中1～2 h，再轉(zhuǎn)移至31℃充分氧和的人工腦脊液灌流槽中進(jìn)行電位記錄。

1.2.2 海馬谷氨酸能神經(jīng)元的選擇 使用IR-DIC光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司，E600FN型）在腦片中選擇海馬谷氨酸能神經(jīng)元，其在波長575 nm光激發(fā)下可發(fā)出黃色熒光。

1.2.3 海馬谷氨酸能神經(jīng)元記錄和指標(biāo)測定 使用Axoclamp-200B放大器膜片鉗電流鉗模式記錄海馬谷氨酸能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环彘g距（inter-spike interval，ISI），電壓鉗模式記錄自發(fā)性興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory postsynaptic current，sEPSC）。將電信號輸入到 pClamp-10（Axon Instrument Inc，F(xiàn)oster CA，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。按照實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置去極化電流脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，誘發(fā)動(dòng)作電位，放大器的高頻濾波為3 kHz。電壓鉗模式下將神經(jīng)元膜電位鉗制在-65 mV記錄自發(fā)sEPSC。膜片鉗電極管內(nèi)充滿標(biāo)準(zhǔn)電極液，滲透壓為 295～305 mOsmol，電極阻抗為 5～6 MΩ。ISI表示動(dòng)作電位的發(fā)放能力，指去極化電流脈沖誘發(fā)動(dòng)作電位中相鄰兩個(gè)動(dòng)作電位峰頂點(diǎn)間的距離（圖1）。統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞膜靜息膜電位超過-70 mV的數(shù)據(jù)。sEPSC包括電流發(fā)放的間隔和幅度（圖2）。sEPSC的間隔和幅度結(jié)果以累積概率的50%表示，以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較[10]。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠海馬谷氨酸能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢籌SI比較 見圖 1、表 1。

由圖1、表1可見，Pannx1組小鼠海馬谷氨酸能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢籌SI較癲癇組延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；癲癇組ISI較對照組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 3組海馬谷氨酸能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢籌SI的變化（ms）

圖1 3組小鼠海馬谷氨酸能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢簧窠?jīng)元?jiǎng)幼麟娢环彘g距（ISI）比較（a：癲癇組；b：Pannx1組；c：對照組）

2.2 3組小鼠海馬谷氨酸能神經(jīng)元sEPSC比較 見圖2、表 2。

表2 3組海馬谷氨酸能神經(jīng)元sEPSC間隔及幅度的變化

圖2 3組小鼠海馬谷氨酸能神經(jīng)元自發(fā)性興奮性突觸后電流（sEPSC）比較

由圖2、表2可見，與對照組比較，Pannx1組、癲癇組海馬谷氨酸能神經(jīng)元sEPSC間隔縮短，幅度增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與癲癇組比較，Pannx1組sEPSC間隔增加、幅度減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

癲癇的發(fā)病機(jī)制是近年來研究的熱點(diǎn)，目前研究認(rèn)為癲癇的發(fā)生是由于興奮性神經(jīng)元活性增強(qiáng)和谷氨酸釋放量增加，或抑制性神經(jīng)元活性減弱和抑制性氨基酸遞質(zhì)釋放量減少造成的。谷氨酸能神經(jīng)元是腦內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)元，各類癲癇的發(fā)生幾乎均與其興奮性變化有關(guān)。谷氨酸能神經(jīng)元形態(tài)呈錐形，有明顯的軸樹突，其典型特征是簇發(fā)放。sEPSC是由動(dòng)作電位誘發(fā)的谷氨酸能神經(jīng)元釋放谷氨酸而引起的自發(fā)興奮性突觸后電流。其中sEPSC的間隔表示單位時(shí)間內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元釋放谷氨酸的數(shù)量變化，包括谷氨酸能神經(jīng)元遞質(zhì)的釋放和由動(dòng)作電位誘發(fā)的谷氨酸能神經(jīng)元遞質(zhì)釋放數(shù)目增減；sEPSC的幅度變化反映單位時(shí)間內(nèi)突觸前遞質(zhì)釋放量和突觸后膜受體數(shù)目或受體的反應(yīng)性變化。sEPSC的間隔和幅度代表神經(jīng)元接受外來信號并產(chǎn)生sEPSC的能力。ISI表示動(dòng)作電位的輸出能力，是神經(jīng)元興奮性的重要指標(biāo)。本研究使用匹魯卡品建立癲癇動(dòng)物模型，利用電壓鉗和電流鉗記錄海馬的谷氨酸能神經(jīng)元sEPSC和ISI。通過研究發(fā)現(xiàn)在相同刺激強(qiáng)度、刺激時(shí)間下癲癇組較對照組ISI均明顯降低，sEPSC間隔縮短、幅度增大，表明癲癇發(fā)作后谷氨酸能神經(jīng)元發(fā)放的動(dòng)作電位個(gè)數(shù)增多，興奮性升高，發(fā)放沖動(dòng)增加。

Pannx是10年前發(fā)現(xiàn)的一類膜蛋白通道，這些通道介導(dǎo)了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外空間之間的分子交換[11]。Pannx1是Pannx家族中唯一被證明可以形成功能通道的成員。Pannx1通道可以在多種情況下被激活，包括機(jī)械應(yīng)激、去極化、胞外K+升高、胞內(nèi)Ca2+、嘌呤能受體激活或缺血[12-15]。Pannx1通道的開放被認(rèn)為有害，主要見于炎癥、缺血性腦卒中或急性癲癇活動(dòng)等病理狀態(tài)[16-18]。Dossi等[19]研究發(fā)現(xiàn)Pannx1通道激活通過嘌呤能2受體的三磷酸腺苷信號通路促進(jìn)癲癇發(fā)作的產(chǎn)生和維持。Thompson等[7]在分離的海馬錐體神經(jīng)元研究中發(fā)現(xiàn)NMDA受體激活后繼發(fā)的內(nèi)向電流系Pannx 1通道開放所致，在海馬腦片中的研究中發(fā)現(xiàn)Pannx1干擾肽能顯著降低NMDA誘導(dǎo)的癲癇樣放電頻率和幅度以及阻斷并抑制錐體神經(jīng)元攝取熒光染料，以上結(jié)果顯示Pannx1通道可能在癲癇異常電活動(dòng)中扮演重要角色，阻斷Pannx1通道能抑制癲癇發(fā)作。

目前用于治療瘧疾的藥物甲氟喹對Pannx1通道有藥理抑制作用。Pinheiro等[12，20-21]在研究中發(fā)現(xiàn)甲氟喹可抑制海人酸模型小鼠癲癇自發(fā)發(fā)作的頻率和總時(shí)間，強(qiáng)烈抑制癲癇發(fā)作。本研究使用甲氟喹阻斷Pannx1通道，結(jié)果顯示Pannx1組較癲癇組海馬谷氨酸能神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏腎SI升高、sEPSC間隔增大、幅度降低，說明甲氟喹阻斷Pannx1通道能使癲癇小鼠海馬谷氨酸能神經(jīng)元興奮性降低，有抑制神經(jīng)元興奮性的作用，且甲氟喹有抗癲癇作用。甲氟喹通過血腦屏障有立體選擇性，在大腦的不同區(qū)域會(huì)達(dá)到不同的濃度。盡管甲氟喹是Pannx1的良好抑制劑[22]，但在少數(shù)瘧疾患者中已被證明可誘發(fā)癲癇發(fā)作[23-24]。甲氟喹由于作用于不同的靶點(diǎn)如神經(jīng)元、星形細(xì)胞、鈉離子通道或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，而表現(xiàn)出多種不良反應(yīng)[25]。這些報(bào)道顯示甲氟喹用于治療癲癇存在明顯的局限性。

綜上所述，甲氟喹阻斷Pannx1通道能抑制癲癇小鼠海馬谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性，但由于其不良反應(yīng)，很難被認(rèn)為是潛在的抗癲癇藥物，希望未來能不斷發(fā)現(xiàn)具有高選擇性的Pannx1通道阻斷劑，增加癲癇治療藥物的種類，從而控制難治性癲癇。