陳哲，王勤寧，黃璐捷，史信寶，胡靜

寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院，浙江 寧波 315040，1.心胸外科；2.放療科

肺癌具有較高的發(fā)病率及病死率，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，治療效果及預(yù)后不理想[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，靶向治療成為肺癌治療的新方法，尋找有效的肺癌治療靶點(diǎn)具有重要意義。大 量研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）及微小RNA（microRNA，miRNA）與肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可作為肺癌診療的特異性靶點(diǎn)[2]。肌聯(lián)蛋白反義RNA1（titin antisense RNA1，TTN-AS1）是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，發(fā)揮促癌作用，有研究顯示，在甲狀腺癌、食管癌、骨肉瘤等多種腫瘤中l(wèi)ncRNA TTN-AS1異常表達(dá)，其表達(dá)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[3-5]。有研究顯示，肺癌中TTN-AS1高表達(dá)，抑制其表達(dá)可降低癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力[6]。有研究報(bào)道，過表達(dá)miR-1271可在體內(nèi)體外抑制肺癌生長[7]；lncRNA TTN-AS1可通過靶向抑制miR-1271促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[8]。TTNAS1和miR-1271都可影響肺癌進(jìn)展，且lncRNA TTNAS1和miR-1271存在靶向關(guān)系，但TTN-AS1是否可通過調(diào)節(jié)miR-1271影響肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡尚未可知。本研究以肺癌A549細(xì)胞為研究對象，旨在探討TTN-AS1調(diào)節(jié)miR-1271對肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響及可能的分子機(jī)制，為肺癌分子水平的治療提供一定的參考及依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購日本Djingo公司；Transwell小室購自美國Corning公司；細(xì)胞凋亡試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、RIPA裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin、cleaved caspase 3和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1 （3-phosphate dependent protein kinase 1，PDK1）抗體購自美國Abcam公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；RT-PCR儀購自瑞士Roche公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；FACScan流式細(xì)胞儀購自德國BD Biosicences公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞購自美國ATCC。常規(guī)復(fù)蘇凍存的A549細(xì)胞后，使用含10% FBS及1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天換液1次，待細(xì)胞貼壁且占滿80%～90%培養(yǎng)皿面積時(shí)進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用Lipofectamine 2000進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。選擇對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，按照2 mL/孔接種于6孔板，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞生長達(dá)70%～80%融合時(shí)，更換為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用適量Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋Lipo 2000、TTN-AS1 siRNA（si-TTN-AS1）及陰性對照（si-NC）、pcDNA-TTN-AS1及空載體（pcDNA）、miR-1271 mimics及miR-NC、miR-1271 inhibitors（anti-miR-1271）及anti-miR-1271。將稀釋后的各轉(zhuǎn)染組與Lipofectamine 2000混勻，室溫靜置 30 min。將混合液加入6孔板內(nèi)，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育6 h，更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.4 qRT-PCR檢測TTN-AS1和miR-1271表達(dá) 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA稀釋10倍，按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣本設(shè)置5個(gè)重復(fù)，相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：TTN-AS1：F：5’- CGGGAACAAGCCCTGTG-3’，R：5’-CCGGCCCAAAGATGATG- 3’；GAPDH：F：5’-TGCACCACCACCTGCTTAGC-3’，R：5’- GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’；miR-1271：F：5’-CTAGA CGTCCAGATTGAATAGAC-3’，R：5’-GTCCGAGCTTGGTC-AG AATG-3’；U6：F：5’-CTCGCTT-CGGCAGCACA-3’，R：5’-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 以5×103個(gè)/孔將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，于培養(yǎng)箱常規(guī)孵育24 h，按照上述方法轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，在每孔加10 μL的CCK-8反應(yīng)液，混勻，于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm的光密度值（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 Transwell小室上室加100 μL的Matrigel基質(zhì)膠（基質(zhì)膠:無血清培養(yǎng)基為1:4），待基質(zhì)膠凝固后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。收集按照上述分組轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，不含血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL。取300 μL細(xì)胞懸液，加入Transwell小室上室，下室加500 μL含血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)24 h，去掉小室細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗，棉簽擦凈上室未穿過膜細(xì)胞，多聚甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5× 105個(gè)/mL。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入binding buffer重懸細(xì)胞，離心，棄掉上清液，PBS洗滌細(xì)胞2次。加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育20 min。上機(jī)檢測前再加入300 μL的binding buffer，1 h內(nèi)通過FACScan流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá) 在轉(zhuǎn)染48 h 的各組細(xì)胞中加適量RIPA裂解液，冰上反應(yīng)30 min，4 ℃離心，收集上清液。取適量上清液，BCA法檢測蛋白樣品濃度。根據(jù)蛋白樣品體積加loading buffer，混勻，100 ℃變性5 min。按照40 μg/孔將變性蛋白加入至SDS-PAGE凝膠（5%濃縮膠和12%分離膠），電泳結(jié)束后4 ℃轉(zhuǎn)PVDF膜1.5 h，加5%脫脂奶粉封閉膜2 h。將膜放置在含PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3（1:1 000稀釋）的孵育盒中，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜。轉(zhuǎn)移膜至1:2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中，室溫孵育1 h，洗膜。膜上滴加ECL顯色液，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Quantity One軟件分析各抗體條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示TTN-AS1和PDK1的3’UTR有可與miR-1271結(jié)合的位點(diǎn)。構(gòu)建含結(jié)合位點(diǎn)的TTN-AS和PDK1的野生型（WT）及突變型（MUT）3’UTR報(bào)告質(zhì)粒。以5×104個(gè)/孔將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞生長達(dá)80%融合時(shí)，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明，將報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-1271 mimics及miR-NC轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。結(jié)果以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性比值表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制TTN-AS1表達(dá)對肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TTN-AS1 siRNA的A549細(xì)胞TTN-AS1表達(dá)明顯低于si-NC組（P＜0.05），表明構(gòu)建的抑制TTN-AS1表達(dá)的A549細(xì)胞成功。CCK-8實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TTN-AS1組細(xì)胞增殖能力明顯降低，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯下降，凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖1和表1。

圖1 抑制TTN-AS1表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡和侵襲能力的影響

2.2 抑制TTN-AS1表達(dá)對A549細(xì)胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TTN-AS1組PI3K、p-AKT和PCNA表達(dá)明顯降低，E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá)明顯升高 （P＜0.05）。見圖2。

表1 抑制TTN-AS1表達(dá)后的A549細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡情況

2.3 過表達(dá)miR-1271對肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-1271 mimics 的A549細(xì)胞TTN-AS1表達(dá)明顯低于si-NC組（P＜0.05），表明構(gòu)建過表達(dá)miR-1271的A549細(xì)胞成功。CCK-8實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-1271組細(xì)胞增殖能力明顯降低，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯下降，凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖3和表2。

圖2 抑制TTN-AS1表達(dá)對A549細(xì)胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá)的影響

2.4 過表達(dá)miR-1271對A549細(xì)胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá)的影響 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路及與細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與miRNC組比較，miR-1271組PI3K、p-AKT和PCNA表達(dá)明顯降低，E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見圖4。

2.5 TTN-AS1可靶向調(diào)控miR-1271的表達(dá) 生物信息學(xué)TargetScan軟件預(yù)測結(jié)果顯示（見圖5），TTNAS1與miR-1271序列中存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示（見表3），miR-1271組野生型TTN-AS1熒光素酶活性較miR-NC組明顯降低（P＜0.05），而突變型TTN-AS1熒光素酶活性較miR-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示（見表4），抑制TTN-AS1表達(dá)可明顯上調(diào)miR-1271表達(dá)，而過表達(dá)TTN-AS1可明顯下調(diào)miR-1271表達(dá)（P＜0.05）。說明lncRNA TTN-AS1與miR-1271存在靶向關(guān)系，且可負(fù)調(diào)控miR-1271表達(dá)。

圖3 過表達(dá)miR-1271對A549細(xì)胞凋亡和侵襲能力的影響

2.6 抑制miR-1271可逆轉(zhuǎn)抑制TTN-AS1對A549細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響 各組細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡檢測結(jié)果顯示（見表5），與si-TTN-AS1組比較，si-TTN-AS1+anti-miR-1271組細(xì)胞增殖能力明顯降低，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯下降，凋亡率明顯升高（P＜ 0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示（見表6），與si-TTN-AS1組比較，si-TTN-AS1+anti-miR-1271組PI3K、p-AKT和PCNA表達(dá)明顯升高，E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

表2 過表達(dá)miR-1271后的A549細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡情況

2.7 TTN-AS1可調(diào)節(jié)miR-1271靶基因PDK1表達(dá)生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示（見圖6），miR-1271和PDK1有可結(jié)合的位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示（見表7），miR-1271 mimics與野生型PDK1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而與突變型PDK1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05）。Western blot結(jié)果顯示（見圖7-8），過表達(dá)miR-1271和抑制TTN-AS1表達(dá)明顯下調(diào)PDK1表達(dá)，而抑制miR-1271表達(dá)和過表達(dá)TTN-AS1可明顯上調(diào)PDK1表達(dá)（P＜0.05）。提示miR-1271與PDK1存在靶向關(guān)系，miR-1271和TTN-AS1均可調(diào)控PDK1表達(dá)。

圖4 過表達(dá)miR-1271對A549細(xì)胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá)的影響

圖5 TTN-AS1的序列含有與miR-1271互補(bǔ)的核苷酸序列

表3 TTN-AS1 WT/MUT與miR-1271 mimics共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性

表4 lncRNA TTN-AS1調(diào)節(jié)miR-1271表達(dá)

3 討論

lncRNA是一類不編碼的RNA分子，長度大于200 nt，可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。多種腫瘤中l(wèi)ncRNA異常表達(dá)，發(fā)揮促癌或抑癌作用，參與癌細(xì)胞的多種生物學(xué)過程[9-10]。lncRNA TTN-AS1是一個(gè)促癌基因，在多種腫瘤中高表達(dá)，如CHEN等[11]研究顯示，抑制TTNAS1表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力；LI 等[12]研究顯示，抑制TTN-AS1表達(dá)可降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，抑制TTN-AS1表達(dá)可降低A549細(xì)胞增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究顯示TTN-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-142-5p/CDK5抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力[13]。

表5 抑制miR-1271可逆轉(zhuǎn)抑制TTN-AS1對A549細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響

表6 各組細(xì)胞PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3蛋白相對表達(dá)量

圖6 miR-1271的序列含有和PDK1互補(bǔ)的核苷酸序列

表7 PDK1 WT/MUT與miR-1271 mimics共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性

圖7 過表達(dá)或抑制miR-1271對PDK1蛋白表達(dá)的影響

圖8 過表達(dá)或抑制TTN-AS對PDK1蛋白表達(dá)的影響

近年的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可作為miRNA“海綿”，降低組織及細(xì)胞中靶miRNA豐度，降低miRNA對mRNA結(jié)合作用及抑制mRNA翻譯，從而增強(qiáng)miRNA靶蛋白表達(dá)水平[14]。本研究結(jié)果顯示，TTN-AS1和miR-1271存在靶向關(guān)系，過表達(dá)TTN-AS1可下調(diào)miR-1271表達(dá)，抑制TTN-AS1表達(dá)可上調(diào)miR-1271表達(dá)。過表達(dá)miR-1271可明顯抑制A549細(xì)胞增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而抑制miR-1271可逆轉(zhuǎn)抑制TTN-AS1對細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響。提示TTN-AS1可靶向調(diào)節(jié)miR-1271影響肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡。PDK1是一個(gè)絲/蘇氨酸蛋白激酶，大小為67 kDa，在細(xì)胞生長、凋亡、分化等病理生理過程中發(fā)揮重要作用[15]。多種腫瘤中PDK1均呈現(xiàn)高表達(dá)，可作為一種原癌基因參與腫瘤進(jìn)展[16-17]。有研究顯示，干擾PDK1表達(dá)可通過抑制AKT/FoxO1通路降低肺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。miR-1271可通過靶向PDK1調(diào)控AKT/MTOR信號通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞進(jìn) 展[19]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-1271及抑制TTN-AS1均可下調(diào)PDK1表達(dá)，抑制miR-1271及上調(diào)TTN-AS1均可上調(diào)PDK1表達(dá)。提示TTN-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-1271/PDK1影響肺癌細(xì)胞生長。

PI3K/AKT是一條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號途徑，近年研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中PI3K/AKT信號過度表達(dá)和活化[20-21]。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白，PI3K可通過磷酸化Ser473和Thr308位點(diǎn)刺激AKT的活化，AKT活化后可通過調(diào)節(jié)下游分子表達(dá)，從而影響腫瘤生長[22]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，E-cadeherin是EMT過程的標(biāo)志物，其表達(dá)降低可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[23]。Caspase 3 是凋亡相關(guān)的Caspase家族效應(yīng)蛋白，其活化可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。有研究顯示，lncRNA TTN-AS1可通過調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號通路影響胃癌進(jìn)展[25]。 本研究結(jié)果顯示，抑制TTN-AS1表達(dá)及過表達(dá)miR-1271均可下調(diào)PI3K、p-AKT和細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA表達(dá)，上調(diào)E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá)，同時(shí)抑制TTN-AS1和miR-1271可逆轉(zhuǎn)抑制TTNAS1對PI3K、p-AKT、PCNA、E-cadherin和cleaved caspase 3表達(dá)的影響；lncRNA TTN-AS1可通過靶向調(diào)節(jié)miR-1271/PDK1并抑制PI3K/AKT信號通路影響肺癌細(xì)胞生長。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)可降低肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與靶向miR-1271/PDK1分子并抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)。