李蘭蘭，劉偉姣，肖波，張山珊，郭佳慧，賈杏林

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128）

犬瘟熱（Caninedistemper，CD）是由犬瘟熱病毒（CDV）引起的一種嚴(yán)重傳染病，屬于副粘病毒科的麻疹病毒屬[1]。CDV可以感染不同年齡、性別和品種的狗。除犬科動(dòng)物外，許多動(dòng)物種類，例如貓科，鼬科，浣熊科和靈長類動(dòng)物也易感染CDV[2]。該病在我國的爆發(fā)流行最早要追溯到于1968年爆發(fā)該病的黑龍江省撫遠(yuǎn)縣某貂場。此后，該病的流行由華北地區(qū)逐漸蔓延到華南、華中地區(qū)，直至上世紀(jì)80年代已有九省三十多縣市七十多個(gè)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場遭受該病的侵襲[3]。

隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，越來越多的人開始養(yǎng)寵物，犬瘟熱也成為我們身邊常見的寵物疾病。該病對(duì)犬危害極大，致死率極高。尤其是神經(jīng)型犬瘟熱,病犬大都預(yù)后不良,就算被治愈，也會(huì)留下抽搐的后遺癥。其抽搐的癥狀可隨時(shí)間的推移而減輕,但終不消失[4]。該病嚴(yán)重威脅養(yǎng)犬業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[5]，因此犬瘟熱病毒的分離培養(yǎng)對(duì)犬瘟熱的檢測及疫苗制備極其重要。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)器材

網(wǎng)購小型中信孵化箱、生化培養(yǎng)箱、無菌操作臺(tái)、高壓蒸汽鍋、酒精燈、鑷子、鑿蛋器、勻漿器、組織剪、一次性注射器、蛋架、神經(jīng)型犬瘟熱病例肺臟，犬瘟熱快速檢測試紙（Anigen Rapid）、衛(wèi)佳伍疫苗(碩騰公司)

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥劑

硫酸鏈霉素(圣旺藥業(yè))、阿莫西林克拉維酸鉀（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）、0.9%氯化鈉（山東科倫藥業(yè)有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞胚培養(yǎng)

雞胚培養(yǎng)法是用來培養(yǎng)某些對(duì)雞胚敏感的動(dòng)物病毒的一種方法，是病毒培養(yǎng)學(xué)的重要方法之一。

雞胚應(yīng)選擇健康無病雞群或SPF雞群的新鮮受精蛋，用孵化箱孵化，選擇相對(duì)濕度為60%，最低溫度36℃，一般37.5℃的條件下進(jìn)行孵化。

分6個(gè)批次按照上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)，記錄并挑選相應(yīng)批次發(fā)育正常的雞胚的數(shù)目。

1.2.2 接種方法

病料為可能被污染的固體材料，在取樣剪碎研磨后，加入研磨液十分之一量的雙抗，置于冰箱12~24小時(shí)。

將孵化9~12日齡后的雞胚放在照蛋器下，用鉛筆勾出氣室以及接種部位。

將雞胚放置在無菌工作臺(tái)中，依次使用75%酒精—碘酒—75%酒精的方法進(jìn)行消毒，使用鑿蛋器進(jìn)行打孔。

將病料或雞胚液從孔中注射入要接種的部位，用石蠟封孔后于37℃生化培養(yǎng)箱中孵育5天。

實(shí)驗(yàn)采用卵黃囊接種和尿囊腔接種的方法。

1.2.3 胚液提取方法

棄去48h內(nèi)死亡雞胚，將接種5天后未死亡雞胚放入冰箱凍死。

將收獲的雞胚從冰箱取出，在無菌環(huán)境下提取胚液。按照75%酒精—碘酒—75%酒精的順序消毒蛋殼，再用鑷子打開雞胚氣室，撕開氣室膜和尿囊腔膜使用注射器吸取胚液，將胚液置于干凈抗生素瓶中，放于冰箱冷藏保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

第1~3批采用的是卵黃囊接種不同劑量研磨液。

第1批中，將培養(yǎng)出來的正常的雞胚，隨機(jī)編號(hào)分組，分別接種0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.3mL、0.35mL等梯度劑量的研磨液。

第2批中，將培養(yǎng)出來的正常的雞胚，隨機(jī)編號(hào)分組，以第1批培養(yǎng)的雞胚夜作為接種物，每組設(shè)置的劑量梯度為0.1mL、0.2mL、0.3mL。

第3批中，以養(yǎng)殖場土雞蛋作為受精雞胚，按照第一批中的方法和梯度劑量試驗(yàn)。

第4批還是采用的是卵黃囊接種不同劑量研磨液，但研磨液經(jīng)離心機(jī)中以10000r/min速度離心10 min后取上清液。以第三批批雞胚培養(yǎng)時(shí)的研磨液、衛(wèi)佳伍疫苗作為接種對(duì)照，進(jìn)行分組試驗(yàn)。

第5批采用的接種方法是尿囊腔接種，從雞胚側(cè)面開孔，避開血管注射。該批次雞胚培養(yǎng)研磨液放于離心機(jī)中以10000r/min的速度離心10min，取上清液；以第4批2枚雞胚分別接種0.1mL和0.2mL的衛(wèi)佳伍疫苗作為對(duì)照試驗(yàn)。

第6批采用同第五批一樣的尿囊腔接種，該批次的雞胚培養(yǎng)研磨液放于離心機(jī)中以10000 r/min的速度離心10min，取上清液，正常的雞胚編號(hào)，每個(gè)編號(hào)添加研磨上清液0.3mL。

1.4 胚液檢測方法

提取每個(gè)批次中可以檢測的胚液適量，用于檢測。

（1）將少量胚液滴在試紙板上，若濃度過大使用吸管吸取胚液至稀釋液中攪拌后滴在試紙板上，等待10~15min觀察結(jié)果。

（2）根據(jù)檢測線與對(duì)照線的結(jié)果判斷陰性和陽性。對(duì)照線位置出現(xiàn)紅色條帶試驗(yàn)成立，如果測試線位置出現(xiàn)紅色條帶則判為CDV陽性，如果測試線位置不出現(xiàn)紅色條帶則判為CDV陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胚培養(yǎng)

第1、2批采用SPF雞胚,以卵黃囊接種方法分別培養(yǎng)出12枚、15枚發(fā)育正常的雞胚。

第3批采用農(nóng)村養(yǎng)殖場土雞蛋，以卵黃囊接種方法培養(yǎng)出7枚發(fā)育正常的雞胚。

第4批采用SPF雞胚,以卵黃囊接種方法但研磨液經(jīng)過高速離心后培養(yǎng)出13枚發(fā)育正常的雞胚。

第5、6批采用SPF雞胚,采用的是尿囊腔接種，研磨液經(jīng)過高速離心,分別培養(yǎng)出13枚、8枚發(fā)育正常的雞胚。

2.2 CDV病毒培養(yǎng)結(jié)果

雞胚接種病毒研磨液后進(jìn)行病毒培養(yǎng)后收獲雞胚尿囊液，每個(gè)批次雞胚液進(jìn)行CDV試紙檢測，從表1可知，第1批接種12枚雞胚，1枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性；第4批接種13枚雞胚，1枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性；第5批接種13枚雞胚，6枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性；第6批接種8枚雞胚，1枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性。衛(wèi)佳伍疫苗接種2枚雞胚，1枚雞胚尿囊液檢測CDV陽性。

表1 六次雞胚培養(yǎng)結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)先后采用卵黃囊接種及尿囊腔接種的方法，并嘗試接種病料研磨液和病料研磨上清液，最終成功提取出神經(jīng)性犬瘟熱病毒液。

由表1可以看出，第五批更換了接種方法，改為從側(cè)面尿囊腔接種病料研磨上清液后，檢驗(yàn)結(jié)果與前幾次實(shí)驗(yàn)相比較為良好，且雞胚存活率較前幾次實(shí)驗(yàn)有明顯提升，表明使用側(cè)面接種尿囊腔相比于使用氣室接種卵黃囊更不容易傷及雞胚。第六批雞胚培養(yǎng)相比第五批，接種時(shí)增大了病毒研磨上清液的劑量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示接種后八枚雞胚僅有一枚含有CDV，推測是由于本次病毒液的劑量過大導(dǎo)致，表明雞胚接種犬瘟熱病料研磨上清液最佳接種量是0.25mL。

3 討論

在第一批雞胚培養(yǎng)中，將雞胚分6組進(jìn)行不同劑量研磨液的接種，雖然可以避免出現(xiàn)濃度過高或過低導(dǎo)致雞胚實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想的狀況，但是每組實(shí)驗(yàn)對(duì)象較少，對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果不明顯；第二批均未培養(yǎng)出病毒，猜測可能是第一批培養(yǎng)出的病毒濃度過低，活性較弱，或是接種過程中被污染，所以在雞胚接種過程中一定要在無菌條件下進(jìn)行，避免外界對(duì)雞胚造成污染導(dǎo)致雞胚死亡；第三批雞胚培養(yǎng)使用的受精雞胚為農(nóng)村養(yǎng)殖場土雞蛋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是全部雞胚死亡，推測是猜測可能母源抗體量較高導(dǎo)致全部雞胚死亡，因此在雞胚接種培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中使用SPF雞胚較好。

六次雞胚培養(yǎng)獲得的陽性結(jié)果中，試紙檢測線顏色相對(duì)于對(duì)照線均較淺，表明雞胚接種培養(yǎng)犬瘟熱病毒雖能成功培養(yǎng)出病毒，但培養(yǎng)出的病毒濃度較低。對(duì)于如何在雞胚接種培養(yǎng)犬瘟熱病毒實(shí)驗(yàn)中提高培養(yǎng)出的病毒液的效價(jià)還需要進(jìn)一步研究?！?/p>