李道宏，胡愛俠，靳鈺煒

河南省人民醫(yī)院病理科，鄭州 450000

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率和病死率均較高，尤其高發(fā)于發(fā)展中國家。胃癌患者確診時常已經(jīng)處于晚期，預后較差、生存率低，因此，提高胃癌的早期診斷率，早期治療，才能延長胃癌患者的生存期。眾所周知，遠處轉(zhuǎn)移是導致惡性腫瘤患者死亡的主要原因，但遠處轉(zhuǎn)移需多種蛋白、多種基因共同參與，且需經(jīng)過多個步驟才能完成，而細胞增殖、遷移和侵襲是惡性腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的主要特征。胃癌細胞具有較強的侵襲和遷移能力，可促使胃癌早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移，或在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生進一步變化，導致化療失敗，并誘導胃癌復發(fā)或發(fā)生更深層的轉(zhuǎn)移。因此，明確胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移機制有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種單鏈小分子RNA，長度18～25 nt，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮至關重要的作用，主要通過與靶蛋白結(jié)合調(diào)控細胞功能。腫瘤細胞的侵襲和遷移離不開上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）、Dicer1等的調(diào)控。研究表明，miRNA-186在食管癌中低表達，且生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-186可能靶向調(diào)控Dicer1，但其在胃癌中的作用機制鮮有相關報道，因此，本研究通過觀察miRNA-186在胃癌中作用機制，旨在為胃癌的早期診斷和靶向治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月至2019年6月河南省人民醫(yī)院收治的胃癌患者。納入標準：①經(jīng)胃鏡和病理組織學檢查確診為胃癌；②未合并其他嚴重疾病。排除標準：①癌旁組織有明顯的炎性細胞浸潤；②合并胃潰瘍、胃糜爛；③合并其他惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入40例胃癌患者，其中男22例，女18例；平均年齡（61.35±5.65）歲；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期16例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例；分化程度：低分化28例，中高分化12例。取40例胃癌患者的胃癌組織及相應的癌旁正常組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞、主要試劑和儀器 胃癌細胞BGC-823、正常胃黏膜上皮細胞RGM-1、共轉(zhuǎn)染293FT細胞均購自中科院上海細胞研究所，pLVTHM-mimic-miRNA-186、pLVTHM-mimic-NC、miRNA-186及GAPDH引物均由上海吉瑪設計合成。Anti-Dicer抗體[4A6]（ab82539）、Anti-N-cadherin 抗體（ab76057）、山羊抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor488）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG H&L（ab205719）均購自美國Abcam公司，Transwell小室購自美國BD公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Vector公司。SANYO MCO-15AC細胞培養(yǎng)箱購自美國強生公司，超凈工作臺購自北京六一儀器廠，5810R型高速離心機購自日本島津公司。

1.2.2 構(gòu)建穩(wěn)定過表達miRNA-186細胞系 取對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞濃度至1×10/L，加入至6孔板中，置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞融合度達70%時嚴格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，分別將pLVTHM-mimic-miRNA-186和pLVTHM-mimic-NC轉(zhuǎn)染至293FT細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集慢病毒感染液，分別轉(zhuǎn)染BGC-823細胞，得到過表達的BGC-823-mimics-miRNA-186細胞、陰性對照BGC-823-mimics-NC細胞。

1.2.3 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測組織和細胞中miRNA-186的相對表達量 取胃癌組織及癌旁正常組織，正常胃黏膜上皮細胞RGM-1、胃癌細胞BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186及陰性對照BGC-823-mimics-NC細胞。Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA），在PCR儀上進行擴增，擴增條件：95℃預變性30 s，1個循環(huán)；95℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)；95℃延伸5 s，60℃ 1 min，95℃終止，1個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，2計算miRNA-186的相對表達量。GAPDH正向引物：5'-TGCTCCTCCTCCTGCT-GCTC-3'，反向引物：5'-GCAGAAGGTGGAGGTGCAGC-3'；miRNA-186正向引物：5'-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3'，反向引物：5'-TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC-3'。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 取40 μl的Matrigel膠用不含胎牛血清的RPMI-1640以1∶8稀釋后，水化鋪在Transwell小室的上室底部，取胃癌細胞BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186和BGC-823-mimics-NC細胞消化后，采用1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗 2次。同時，采用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞稀釋至1×10/ml，加入200 μl細胞懸液至 Transwell小室的上室，加入500 μmol含20% FBS的RPMI-1640至Transwell小室的下室，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無氣泡，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室的上室用預冷的PBS沖洗2次，加入500 μl甲醇配制、PBS稀釋的0.1%結(jié)晶紫染液進行染色，室溫避光15 min，PBS漂洗去掉Transwell小室內(nèi)部游離細胞，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照并計數(shù)。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取胃癌細胞BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186和 BGC-823-mimics-NC細胞消化后，采用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×10/ml，加入至6孔板中，置于37℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達90%時，采用10 μl白色槍頭垂直劃線，PBS沖洗，顯微鏡下拍照記為0 h，加入培養(yǎng)基繼續(xù)溫箱培養(yǎng)48 h拍照，然后計算細胞遷移率。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因驗證miRNA-186和

Dicer1

的關系 從PCR擴增http://www.targetscan.org網(wǎng)站得到miRNA-186和

Dicer1

的靶向結(jié)合片段，然后將其插入熒光素酶載體psi-CHECK中，構(gòu)建野生型質(zhì)粒psi-CHECK-Dicer1-wild和突變型質(zhì)粒 psi-CHECK-Dicer1-mutant，以 mimics-NC 為 對照。然后將野生型和突變型質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染至293FT細胞，4 h后采用分光光度計檢測熒光素酶活性（OD）。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測Dicer1蛋白的相對表達量 取正常胃黏膜上皮細胞RGM-1、胃癌細胞 BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186和BGC-823-mimics-NC細胞，胰蛋白酶消化，離心稀釋成細胞懸液，按1×10/孔接種至6孔板中；置入5% CO、37℃培養(yǎng)箱3 h，采用試劑盒提取各組細胞總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白含量。每個樣本取50 μg蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜?；謴椭潦覝睾螅琍BST充分洗膜，加入適量稀釋好的HRP標記的二抗，室溫振蕩1 h，PBST洗膜，電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法顯色，采用Image J軟件分析條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算Dicer1的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 miRNA-186相對表達量的比較

胃癌組織中miRNA-186的相對表達量為（0.26±0.01），明顯低于癌旁組織的（1.07±0.14），差異有統(tǒng)計學意義（

t

=36.932，

P

＜0.01）。胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC中miRNA-186的相對表達量均明顯低于正常胃黏膜上皮細胞RGM-1，穩(wěn)定過表達BGC-823-mimics-miRNA-186細胞中miRNA-186的相對表達量明顯高于胃癌細胞BGC-823、BGC-823-mimics-NC和正常胃黏膜上皮細胞RGM-1，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.01）（表1）。

表1 不同細胞中miRNA-186相對表達量的比較（±s）

2.2 miRNA-186對胃癌細胞BGC-823侵襲和遷移能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，BGC-823-mimicsmiRNA-186細胞侵襲數(shù)目少于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，BGC-823-mimicsmiRNA-186細胞遷移率低于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。（表 2）

表2 miRNA-186對胃癌細胞BGC-823侵襲和遷移能力的影響（±s）

2.3 miRNA-186對N-cadherin的影響

過表達miRNA-186的BGC-823-mimics-miRNA-186細胞中N-cadherin陽性表達率低于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。（表3）

表3 不同細胞N-cadherin表達情況的比較（%，±s）

2.4 miRNA-186對Dicer1的影響

雙熒光素酶報告結(jié)果顯示，mimics-miRNA-186能明顯抑制野生型psi-CHECK-Dicer1-wild的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）；而對突變型psi-CHECK-Dicer1-mutant的熒光素酶活性無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。（表4）

表4 miRNA-186對野生型和突變型Dicer1熒光素酶活性的影響（±s）

2.5 Dicer1蛋白相對表達量的比較

Western blot結(jié)果顯示，胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC中Dicer1蛋白的相對表達量均明顯低于正常胃黏膜上皮細胞RGM-1，且BGC-823-mimics-miRNA-186細胞中Dicer1的相對表達量高于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，差異均有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.01）。（表5）

表5 不同細胞Dicer1蛋白相對表達量的比較（±s）

3 討論

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)，胃癌病死率居所有惡性腫瘤的第三位。因胃癌的局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移導致病死患者逐年上升。中國是胃癌高發(fā)國家，嚴重威脅中國居民的身體健康及生活質(zhì)量。胃癌的發(fā)病機制十分復雜，盡管目前的外科手術和化療手段不斷進步，但胃癌的病死率仍居高不下，患者的5年生存率遠遠低于30%。胃癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移成為影響胃癌患者治療成功的關鍵。因此，探討與胃癌發(fā)生發(fā)展相關的分子及作用機制在胃癌的診斷和治療中有重要意義。miRNA主要通過競爭或靶向調(diào)節(jié)信使RNA（messenger RNA，mRNA）發(fā)揮作用，能參與細胞的增殖、分化和凋亡等過程。近年來，多種實體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了miRNA的異常表達，且能夠通過調(diào)控癌基因來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學特性。miRNA-186作為miRNA成員，共有86個核苷酸，位于染色體lp31.1上，有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-186可靶向下調(diào)子宮內(nèi)膜癌抑癌基因叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖；還有研究顯示，miRNA-186在腫瘤上皮細胞能夠下降凋亡蛋白P2X7的表達來發(fā)揮促癌作用；但也有學者研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-186在原發(fā)性神經(jīng)管細胞瘤中表達下調(diào)，可能發(fā)揮抑癌基因的作用；此外，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-186可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，同時抑制細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）等蛋白的表達。

本研究采用qRT-PCR法檢測組織和細胞中miRNA-186的相對表達量，結(jié)果顯示，胃癌組織和胃癌細胞中miRNA-186均表達下調(diào)，隨后采用慢病毒轉(zhuǎn)讓技術構(gòu)建穩(wěn)定過表達miRNA-186的細胞系，從而觀察其在胃癌中的作用機制。侵襲和遷移能力是腫瘤細胞的重要生物學行為，也是患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移甚至死亡的根本原因。本研究結(jié)果顯示，BGC-823-mimics-miRNA-186細胞侵襲數(shù)目較少、遷移率較低，表明miRNA-186能抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移。侵襲和遷移是惡性腫瘤的基本生物學特征，涉及多種蛋白因子相互協(xié)調(diào)和共同作用，EMT是實體腫瘤發(fā)生侵襲和遷移的重要進程，可能是因為EMT主要是腫瘤細胞從腫瘤母體脫離并向周圍組織轉(zhuǎn)移擴散的起始。作為EMT的標志物，研究表明，N-cadherin在鼻咽癌中表達明顯上調(diào)。本研究經(jīng)IFA觀察發(fā)現(xiàn)，過表達miRNA-186的BGC-823-mimics-miRNA-186細胞中N-cadherin陽性表達率低于胃癌細胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC，提示miRNA-186能夠抑制N-cadherin的表達。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中Dicer1呈低表達，其主要受到miRNA-215的調(diào)控，從而促進肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移；還有學者在漿液性卵巢癌動物模型中發(fā)現(xiàn)，Dicer1能夠明顯抑制卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程，且其水平高低與卵巢癌的進展呈明顯負相關；本研究雙熒光素酶報告實驗證實，miRNA-186能夠靶向調(diào)控Dicer1；此外，Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miRNA-186后，Dicer1表達明顯上調(diào)，提示miRNA-186可正向調(diào)控Dicer1。

綜上所述，miRNA-186通過靶向正調(diào)控Dicer1的表達，下調(diào)N-cadherin的表達，從而發(fā)揮抑制胃癌細胞侵襲和遷移的作用，但仍需進一步采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術調(diào)控Dicer1的表達，觀察Dicer1與EMT的關系。