◎匡逸靜，謝安琪，田 鵬，陶泳兵，沈 奎，李永儒，楊 艷

（1.西南醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫教研室，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，四川 瀘州 646000）

酒精性肝?。ˋlcoholic Liver Disease，ALD）是指長(zhǎng)期攝入酒精所引起的肝臟損傷性疾病，其發(fā)病率和死亡率在全球都處于較高水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群研究均顯示，ALD 與腸道菌群紊亂相互影響[1]，腸道菌群紊亂可由酒精誘導(dǎo)產(chǎn)生，而其在ALD 的發(fā)病和轉(zhuǎn)歸過程中又起著重要的作用，其機(jī)制可能與乳酸桿菌等腸道菌群的生長(zhǎng)被抑制有關(guān)[2-3]。維生素C 作為一種對(duì)氧自由基有很強(qiáng)的清除作用的高效抗氧化劑，它可以通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)受損組織細(xì)胞的修復(fù)，對(duì)酒精引起的肝損傷具有保護(hù)作用[4]；維生素C還可提高腸黏膜的屏障功能，從而降低腸源性感染發(fā)生率，腸道內(nèi)細(xì)菌移位可被抑制，同時(shí)保護(hù)腸黏膜[5-6]。實(shí)驗(yàn)采用酒精灌胃法復(fù)制大鼠酒精性肝損傷模型，給予低、中、高劑量維生素C 干預(yù)，驗(yàn)證維生素C對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用，同時(shí)進(jìn)一步探索維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響，為治療ALD 與發(fā)現(xiàn)新的潛在作用靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 雄性健康大鼠52 只，體重150～180 g，成都達(dá)碩公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（川）2015-030，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（川）2018-065。

1.1.2 試劑

56%vol 紅星二鍋頭白酒（北京紅星股份有限公司）；維生素C（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（Eosin-methylene blue medium，EMB）、BEA 瓊脂培養(yǎng)基、LBS 瓊脂培養(yǎng)基、BL 瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)瓊脂（Plate Count Agar，PCA）均購于青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Versamax 連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（ 美國(guó)Molecular Devices 公司）、5810R 冷凍型臺(tái)式大容量高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）、LD4-2A 型臺(tái)式低速離心機(jī)（北京眾益中和生物技術(shù)有限公司）、HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）、LRH-150 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、GR85DA 全自動(dòng)高壓滅菌器（美國(guó)致微儀器股份有限公司）及HG-9240A 鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）[7]。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將52 只雄性SD 大鼠按體重隨機(jī)分為5 組，據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，酒精模型組大鼠易死亡，故除酒精模型組為12 只大鼠外，其余每組10 只大鼠，其中4 組復(fù)制酒精性肝損傷模型：酒精模型組（以下簡(jiǎn)稱模型組），維生素C 低、中、高劑量干預(yù)組（以下簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組），另設(shè)正常對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱正常組）。

1.3.2 造模與干預(yù)

有研究顯示，在酒精性肝損傷相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中梯度酒精灌胃的造模方式優(yōu)于固定酒精灌胃造模方式[8]，故采用屈勝勝等人所用的梯度酒精灌胃法復(fù)制酒精性肝損傷大鼠模型[9]。除正常組以外，其余各組以56%vol 白酒灌胃，白酒灌胃劑量為第1 周6 mL·kg-1，第2 周8 mL·kg-1，3 周～6 周10 mL·kg-1。維C 低、中、高劑量組分別按大鼠體重20 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、500 mg·kg-1·d-1灌胃維生素C。維生素C 溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，5 h后灌胃白酒，持續(xù)6 周。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)各組大鼠的一般情況，包括毛色、攝食、精神狀態(tài)及活動(dòng)情況等進(jìn)行觀察并記錄，每周稱重。

1.3.3 標(biāo)本的采集、制備與檢測(cè)

按培養(yǎng)基說明書配制不同菌種專用培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)最后一天，無菌操作采集各組大鼠新鮮糞便，稱重，10 倍系列稀釋至10-7g·mL-1。分別取10-5g·mL-1、10-6g·mL-1、10-7g·mL-1濃度的20 μL 糞便稀釋液涂布于PCA 培養(yǎng)基（檢測(cè)需氧菌，37 ℃培養(yǎng)48 h），LBS 瓊脂培養(yǎng)基（檢測(cè)雙歧桿菌，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h），BL 瓊脂培養(yǎng)基（檢測(cè)乳酸桿菌，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h），分別取10-4g·mL-1、10-5g·mL-1、10-6g·mL-1濃度的20 μL糞便稀釋液涂布于EMB 培養(yǎng)基（檢測(cè)大腸桿菌，37 ℃培養(yǎng)48 h）、BEA 培養(yǎng)基（檢測(cè)腸球菌，37 ℃培養(yǎng)48 h）；每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)。按照前述培養(yǎng)條件培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果取對(duì)數(shù)，表示為lgCFU·g-1。

末次灌胃結(jié)束后禁食禁飲12 h，動(dòng)物稱重麻醉（按體重腹腔注射1%戊巴比妥鈉，4 mL·kg-1），腹主動(dòng)脈采血，3 000 r·min-1離心10 min 后取血清，按試劑盒說明檢測(cè)AST、ALT、SOD、MDA。采血完畢后處死大鼠，迅速取出大鼠完整肝臟，冷生理鹽水沖洗濾干，稱重，并按式（1）計(jì)算大鼠肝體比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Excel 2016 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入和整理，SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用±s作統(tǒng)計(jì)描述，單因素方差分析作統(tǒng)計(jì)推斷，LSD法（最小顯著性差異法）作兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠一般情況的影響

正常組毛發(fā)光滑，活躍，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，食欲佳，體重穩(wěn)定增長(zhǎng)。隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組出現(xiàn)毛色無光澤、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、食欲不佳、體重減少及嗜睡等現(xiàn)象，甚至翻正反射暫時(shí)性消失，0.5～1.5 h 后恢復(fù)正常，灌胃時(shí)掙扎劇烈，灌胃后站立不穩(wěn)，實(shí)驗(yàn)中模型組2 只大鼠死亡。維生素C 干預(yù)組大鼠精神、食欲及活動(dòng)狀態(tài)較模型組稍好，但比正常組差。

2.2 維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝體比的影響

與正常組大鼠相比，模型組、維生素C 干預(yù)組肝體比均增高（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，維生素C 干預(yù)組的肝體比均降低（P＜0.05）；各維生素C 干預(yù)組大鼠肝體比無差異（P＞0.05），具體檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝體比的影響表（n=10）

2.3 維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清AST、ALT 的影響

與正常組比較，模型組、維生素C 干預(yù)組血清AST、ALT 均升高（P＜0.05）；與模型組相比，維C 干預(yù)組的大鼠AST、ALT 均降低（P＜0.05）；中劑量組ALT、高劑量組AST、ALT 均低于低劑量組（P＜0.05），其余維C 干預(yù)組AST、ALT 兩兩比較無差異（P＞0.05）。具體檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清AST、ALT 的影響表（n=10）

2.4 維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清SOD、MDA 的影響

與正常組相比，模型組、各維生素C 干預(yù)組血清SOD 均降低，MDA 均升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組SOD均升高，MDA均降低（P＜0.05）；與低劑量組相比，高劑量組SOD 升高，中劑量組和高劑量組MDA 均降低（P＜0.05），高劑量組SOD 高于中劑量組（P＜0.05），其余維C 干預(yù)組SOD、MDA 兩兩比較無差異（P＞0.05）。具體檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠血清SOD、MDA 的影響表（n=10）

2.5 維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響

與正常組相比，模型組大鼠腸道中的需氧菌、大腸桿菌、腸球菌數(shù)量均增加，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均減少（P＜0.05）；與模型組相比，維C 干預(yù)組需氧菌、大腸桿菌、腸球菌均減少，乳酸桿菌均增加（P＜0.05），雙歧桿菌除低劑量組與模型組之間無差異外，中、高劑量組較模型組均增加（P＜0.05）；與低劑量組相比，中劑量組大腸桿菌減少，乳酸桿菌增多，高劑量組的需氧菌、大腸桿菌、腸球菌均減少，乳酸桿菌、雙歧桿菌均增加（P＜0.05）；高劑量組與中劑量組比較除腸球菌減少（P＜0.05）外，其余菌種均無差異。具體檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠腸道菌群數(shù)量的影響表（單位：lgCFU·g-1，n=10）

3 結(jié)論與討論

酒精進(jìn)入人體后90%～98%的氧化代謝都是在肝臟中進(jìn)行，肝臟在酒精代謝過程中至關(guān)重要。許多研究顯示，氧化應(yīng)激是ALD 重要的發(fā)病機(jī)制之一[10]，SOD 是細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系中最重要的一種酶，正常肝臟內(nèi)存在的SOD 能夠清除自由基起到抗氧化的作用，而酒精的攝入引發(fā)自由基攻擊健康肝細(xì)胞，消耗大量SOD，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，MDA 是生物體脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)采用梯度酒精灌胃方式復(fù)制酒精性肝損傷大鼠模型，將大鼠AST、ALT 升高及大鼠肝體比升高作為判斷肝細(xì)胞損傷的標(biāo)準(zhǔn)[11]，將SOD 降低和MDA 增加作為機(jī)體抗氧化失衡的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不佳、毛發(fā)發(fā)黃、肝體比升高現(xiàn)象，血清檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠AST、ALT、MDA 升高，SOD 降低，說明大鼠肝細(xì)胞損傷，出現(xiàn)抗氧化失衡，酒精性肝損傷模型造模成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各維C 干預(yù)組大鼠血清AST、ALT、MDA和肝體比均降低，SOD 升高，且呈現(xiàn)一定劑量反應(yīng)關(guān)系，說明維生素C 對(duì)于酒精造成的大鼠肝損傷具有保護(hù)作用，與相關(guān)研究結(jié)果一致[1,6,12]。

肝臟具有特殊的生理結(jié)構(gòu)，有動(dòng)靜脈和門靜脈兩個(gè)血液循環(huán)系統(tǒng)，通過門靜脈收集各消化道回流的血液，這使肝臟在吸收腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，也暴露于來自腸道的有害微生物產(chǎn)物之中[13]。肝臟特殊的生理結(jié)構(gòu)使其與腸道關(guān)系密切，稱為“肝-腸”軸，也說明ALD 的發(fā)病與腸道微生態(tài)失調(diào)有密切關(guān)系[14-15]。在正常情況下，腸道菌群處于一種動(dòng)態(tài)的平衡中，腸道中的雙歧桿菌和擬桿菌具有維護(hù)腸道黏膜屏障功能和完整性的作用，而大腸桿菌等革蘭氏陰性菌能夠產(chǎn)生內(nèi)毒素，如脂多糖（LPS）可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，降低腸道黏膜通透性[16-17]。許多研究已證實(shí)長(zhǎng)期飲酒的人群和ALD 患者存在體內(nèi)大腸桿菌、腸球菌等有害菌數(shù)量增加，而雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌數(shù)量減少的現(xiàn)象，在實(shí)驗(yàn)中模型組也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果，這說明酒精性肝損傷大鼠出現(xiàn)了腸道菌群的失調(diào)[4]。酒精進(jìn)入機(jī)體后代謝產(chǎn)生的乙醛，在直接引起肝臟損傷的同時(shí)，也可以誘發(fā)腸道的炎癥反應(yīng)，增加腸道黏膜的通透性，由于腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，內(nèi)毒素生成增多，大量LPS 通過腸道黏膜屏障借助門靜脈循環(huán)到達(dá)肝臟，加重肝臟的炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)ALD 的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，維生素C 干預(yù)組大鼠腸道的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量較模型組顯著增多，高劑量組甚至恢復(fù)到正常組水平，而需氧菌、大腸桿菌和腸球菌顯著減少，各干預(yù)組之間呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，與相關(guān)人群研究結(jié)果類似[4]，說明維生素C對(duì)酒精性肝損傷大鼠的腸道菌群失衡有改善作用。

維生素C 可有效降低大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶含量，調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化失衡，改善酒精引起的大鼠肝臟損傷，其作用機(jī)制可能是：維生素C 通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌（如乳酸桿菌、雙歧桿菌）數(shù)量，減少有害菌（如需氧菌、腸桿菌、腸球菌）數(shù)量，改善腸道菌群失調(diào)，保護(hù)腸道黏膜，促進(jìn)肝臟損傷的恢復(fù)。