杜云玲，孔令君，張 睿，吳 潔，竇亞玲

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100730

珠蛋白生成障礙性貧血是由于珠蛋白基因缺失或突變導(dǎo)致珠蛋白肽鏈合成障礙的一種溶血性貧血，其屬于單基因遺傳病，具有嚴(yán)重的危害性，可分為α-珠蛋白生成障礙性貧血和β-珠蛋白生成障礙性貧血[1]。該病廣泛分布于世界各地，全球約有5.00%的人口是α-珠蛋白生成障礙性貧血的攜帶者，其中東南亞為高發(fā)區(qū)之一，在我國多見于南方地區(qū)，北方少見[2-4]。血紅蛋白H病(HbH)屬于α-珠蛋白生成障礙性貧血的中間型，分為缺失型HbH病和非缺失型HbH病。非缺失型HbH病是2個(gè)α基因缺失和1個(gè)α基因突變，結(jié)果只能合成少量正常α珠蛋白肽鏈，與多余的β鏈聚合形成異常的HbH四聚體(β4)，研究顯示非缺失型HbH病比缺失型HbH病的臨床癥狀表現(xiàn)更為嚴(yán)重[5-6]。本研究對(duì)本院1例非缺失型HbH病復(fù)合β-珠蛋白生成障礙性貧血孕婦的血液學(xué)特征和基因型進(jìn)行分析，補(bǔ)充了復(fù)雜少見珠蛋白生成障礙性貧血基因類型的數(shù)據(jù)。此外，為臨床咨詢和產(chǎn)前干預(yù)提供依據(jù)，對(duì)降低珠蛋白生成障礙性貧血的發(fā)病率、促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義[7]。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，女，36歲，孕7+周，2020年6月24日于某院血液內(nèi)科門診進(jìn)行孕前檢查、珠蛋白生成障礙性貧血篩查?；颊咂綍r(shí)血紅蛋白(Hb) 80 g/L，月經(jīng)基本正常，2019年自然流產(chǎn)1次，流產(chǎn)后Hb 60 g/L。本次實(shí)驗(yàn)室檢查，血常規(guī)聯(lián)合網(wǎng)織紅細(xì)胞分析：Hb 78 g/L，平均紅細(xì)胞體積(MCV)62.4 fL，紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(MCH) 16.3 pg，紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC) 261 g/L，紅細(xì)胞分布寬度(RDW )21.00%，網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白含量(RET%)3.47%，網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白含量(RET#) 166.10，網(wǎng)織紅細(xì)胞血紅蛋白(CHr)21.10。外周血紅細(xì)胞形態(tài)分析：紅細(xì)胞大小不等，部分形態(tài)不規(guī)則，中心淡染區(qū)擴(kuò)大，易見靶形紅細(xì)胞，見圖1。Hb電泳：HbA 93.30%，HbA2 2.50%，HbCS 1.60%，HbF 2.60%。

注：視野內(nèi)可見多個(gè)靶形紅細(xì)胞。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 全自動(dòng)血液分析儀XN9100(日本Sysmex公司)；全自動(dòng)電泳儀Minicap-FP(法國Sebia公司)；天隆NP968核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)； Multiskan Go 紫外分光光度計(jì)(美國Thermo公司)；Legend Micro17離心機(jī)(美國Thermo公司)；1300 Series A2生物安全柜(美國Thermo公司)；ABI Veriti96 PCR儀；YN-H16恒溫雜交儀[亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司]；PowerPac Basic電泳儀(美國BioRad公司)；GelDoc XR凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2.2試劑 Ex-DNA全血基因組核酸提取或純化試劑盒購自西安天隆科技有限公司；α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)試劑盒(gap-PCR法)、非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)、β-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)試劑盒(PCR-反向點(diǎn)雜交法)購自亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司。

1.3方法

1.3.1Hb電泳 空腹靜脈血2 mL，EDTA抗凝，采用法國Sebia Minicap-FP 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀，嚴(yán)格按照Hb電泳標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，質(zhì)控合格后上機(jī)檢測(cè)，分離出各Hb成分和比例?？蓹z出正常Hb，包括HbA、HbF和HbA2，還可檢出異常Hb，如HbH、HbCS、HbE、HbS、HbD、HbG、HbBart′s等。

1.3.2基因檢測(cè) 嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。使用全血快速提取試劑盒從EDTA抗凝靜脈血中提取全血基因組DNA。缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)采用gap-PCR方法，檢測(cè)常見的3種類型：--SEA、-α3.7、-α4.2。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.00%瓊脂糖凝膠(用0.50%的TBE配制瓊脂糖)電泳，電壓90 V，電泳70 min，根據(jù)電泳片段大小判斷基因類型。采用PCR-反向點(diǎn)雜交方法檢測(cè)非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因和突變型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因，包括常見的3種非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因類型：αCS(CD142，TAA→CAA)、αQS(CD125，CTG→CCG)、αWS(CD122，CAC→CAG)，以及17種常見的突變型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因類型，分別為CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、CD17(AAG→TAG)、CD71-72(+A)、βE(GAG→AAG)、-29(A→G)、CD43(GAG→TAG)、CD27/28(+C)、CD14-15(+G)、CD31(-C)、-32(C→A)、-30(T→C)、IVS-Ⅰ-1(G→T)、IVS-Ⅰ-5(G→C)、5′UTR；+40-+43(-AAAC)、起始密碼子(ATG→AGG)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針進(jìn)行分子雜交及顯色反應(yīng)，觀察膜條上各位點(diǎn)信號(hào)的有無(信號(hào)為藍(lán)色斑點(diǎn))，確定患者的基因型。

2 結(jié) 果

2.1Hb電泳分析結(jié)果 該孕產(chǎn)婦HbA 降低，為93.30%，HbA2 正常，為2.50%，HbCS升高，為1.60%，HbF升高，為2.60%。

2.2缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因結(jié)果 該孕產(chǎn)婦為SEA缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血，見圖2。

注：889為本例患者，為SEA 缺失型；890、891為健康者；N為陰性對(duì)照；PSEA為SEA缺失型陽性對(duì)照；M為Marker。

2.3非缺失型α-珠蛋白生成障礙性貧血基因結(jié)果 該孕產(chǎn)婦HbCS突變型出現(xiàn)顯色斑點(diǎn)，而HbWS、HbQS野生型出現(xiàn)顯色斑點(diǎn)，結(jié)果為HbCS純合突變。

2.4突變型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因結(jié)果 該孕產(chǎn)婦-28M突變型出現(xiàn)顯色斑點(diǎn)，而41-42N、654N、-28N、71-72N、17N、βEN、31N野生型出現(xiàn)顯色斑點(diǎn)，結(jié)果判斷為β珠蛋白基因-28(A→G)雜合突變。

3 討 論

本例孕婦Hb 78 g/L表現(xiàn)為中度貧血，MCV 62.4 fL，MCH 16.3 pg，MCHC 261 g/L，血象為小細(xì)胞低色素貧血。有研究表明，α-珠蛋白生成障礙性貧血復(fù)合β-珠蛋白生成障礙性貧血后，由于α-鏈合成減少的同時(shí)，β-鏈合成亦減少，二者的不平衡狀態(tài)得以減輕，故患者的貧血程度較單純的α-珠蛋白生成障礙性貧血或單純的β-珠蛋白生成障礙性貧血雜合子患者可以得到一定程度的改善，其貧血癥狀也會(huì)有所減輕，表現(xiàn)為中間型珠蛋白生成障礙性貧血[8]。

當(dāng)進(jìn)行Hb電泳檢測(cè)時(shí)，相較于單純的HbH病患者，HbH病復(fù)合β-珠蛋白生成障礙性貧血患者常出現(xiàn)HbH區(qū)帶及HbA2水平明顯升高的情況[9]。另有研究[10]報(bào)道，約68.40%的HbH病復(fù)合β-珠蛋白生成障礙性貧血患者HbA2水平增高，31.60%患者HbA2水平正常；此外，只有5.20%的HbH病復(fù)合β-珠蛋白生成障礙性貧血患者會(huì)出現(xiàn)HbH。本研究中患者Hb電泳出現(xiàn)HbA2水平正常，未檢出HbH，這與玉晉武等[10]報(bào)道一致，因?yàn)橥瑫r(shí)復(fù)合了β-珠蛋白生成障礙性貧血，致使β鏈不再過剩，HbH水平很低，導(dǎo)致進(jìn)行Hb電泳分析時(shí)未見HbH區(qū)帶。因此，當(dāng)只依靠Hb電泳進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血篩查時(shí)，很容易漏檢或誤診，臨床在依據(jù)血液學(xué)參數(shù)的同時(shí)，必要時(shí)也應(yīng)該進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)，以進(jìn)一步明確診斷，為治療提供可靠依據(jù)。

本例α-珠蛋白生成障礙性貧血孕婦為SEA雜合缺失，CS單體型，即--SEA/αCS，β-珠蛋白生成障礙性貧血為-28(A→G)突變。對(duì)于這種復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血患者，無論同α-珠蛋白生成障礙性貧血或β-珠蛋白生成障礙性貧血患者進(jìn)行婚配，均有可能生育出中間型或重型患兒。α-珠蛋白基因的缺失程度與α-珠蛋白生成障礙性貧血的嚴(yán)重程度相關(guān)。當(dāng)4個(gè)α-珠蛋白基因缺失或缺陷，可導(dǎo)致完全無α鏈生成，此類胎兒僅有γ4(HbBart′s)，可缺氧致死，大多在妊娠30～40周時(shí)成為死胎而流產(chǎn)或早產(chǎn)后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡；3個(gè)α-珠蛋白基因缺失或缺陷，患者僅能合成少量α鏈，容易在紅細(xì)胞內(nèi)變形沉淀而形成包涵體，造成紅細(xì)胞膜僵硬而使紅細(xì)胞壽命縮短，導(dǎo)致HbH病；2個(gè)α-珠蛋白基因缺失或缺陷時(shí)，有相當(dāng)數(shù)量的α鏈合成，攜帶者生理改變輕微；靜止型α-珠蛋白生成障礙性貧血僅有1個(gè)α基因缺失或缺陷，α鏈合成略微減少，患者生理改變非常輕微[11-13]。所以在婚前體檢時(shí)，為了避免下一代出現(xiàn)基因缺陷疾病，應(yīng)該進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血檢查。

珠蛋白生成障礙性貧血作為我國南方常見的遺傳性血液疾病之一，一直以來北方地區(qū)報(bào)道較少，但隨著人口的遷移及南北通婚的增多，北方地區(qū)患病的人數(shù)也有所增加。本研究的病例基因型為非缺失型HbH病復(fù)合β-珠蛋白生成障礙性貧血，該種復(fù)合基因型在南方地區(qū)如廣西、廣東等有發(fā)現(xiàn)，但在北方地區(qū)少有報(bào)道[14-15]。因此，在臨床工作中要重視αβ復(fù)合型珠蛋白生成障礙性貧血的存在，尤其要在北方地區(qū)開展珠蛋白生成障礙性貧血的實(shí)驗(yàn)室診斷，這對(duì)于預(yù)防重型珠蛋白生成障礙性貧血患兒的出生具有重要的指導(dǎo)意義。