溫大科，李天宇

無錫市兒童醫(yī)院血液科，江蘇無錫 214000

傳染性單核細胞增多癥(IM)患兒的免疫因子表達可能發(fā)生異常[1-2]。IM作為以發(fā)熱起病的感染性疾病，免疫因子并非其特異性診斷因素，容易與其他感染性疾病混淆[3]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)由巨噬細胞釋放，在感染性疾病中TNF-α水平可能出現異常；白細胞介素(IL)由白細胞釋放，在感染性疾病發(fā)病過程中起著傳遞抗原信息的作用[4-6]。本研究旨在進一步明確IM與TNF-α、IL的關系，探討上述指標聯合應用對IM的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年12月至2019年12月于本院確診為IM的患兒47例納入IM組，另選擇同期就診的非IM發(fā)熱患兒50例作為非IM發(fā)熱組。納入標準：(1)IM組患兒符合《諸福棠實用兒科學(第8版)》中IM的診斷標準，且為首次診斷[1]；(2)非IM發(fā)熱組患兒均明確診斷為上呼吸道感染，符合《急性上呼吸道感染基層診療指南2018版》標準[7]；(3)腋溫≥37.3 ℃；(4)年齡3～12歲；(5)患兒監(jiān)護人簽署知情同意書。排除標準：(1)血液系統(tǒng)惡性疾??；(2)先天性缺陷或發(fā)育異常；(3)半月內抗菌藥物或免疫抑制劑使用史；(4)器官功能明顯異常；(5)熱程(發(fā)熱天數)超過3 d。

1.2方法 所有患兒均行EB病毒抗體(包括CA-IgM、CA-IgG及NA-IgG)檢測。

1.2.1TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平檢測 抽取患兒空腹靜脈血后分離上清液，使用上海酶聯生物科技有限公司提供的相關酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(雙抗夾心法)對血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平進行檢測，并采用酶標儀對結果進行定量，具體方法如下。將所有試劑充分混勻，注意輕拿輕放，同時緩慢混勻，避免氣泡產生導致取樣誤差。標本用標本稀釋液1∶1稀釋后加50 μL于反應孔內建立標本孔，并將等量的稀釋液加入其他反應孔作為空白孔。立即加入50 μL的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，棄去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次后每孔加入80 μL的親和鏈酶素-辣根過氧化物酶(HRP)，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。而后每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，于37 ℃溫育10 min，孵育過程中避免光照。取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，使用上海譜原儀器有限公司提供的Alpha1500型分光光度計在450 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值。以A值為縱坐標(Y)，相應的待測物質標準品濃度為橫坐標(X)，繪制相應的曲線，樣品中待測物質含量可根據其A值由標準曲線換算出。試劑盒性能：(1)敏感度，最小的檢測濃度小于1號標準品，樣品線性回歸與預期濃度相關系數(R)值為0.990。(2)特異度，不與其他細胞因子反應。(3)重復性，板內、板間變異系數均小于10%。

1.2.2臨床資料及實驗室檢查結果收集 收集患兒臨床資料，包括年齡、性別、出生體質量、熱程、1年內抗菌藥物使用次數、臨床癥狀，以及實驗室檢查結果，包括白細胞計數(WBC)、中性粒細胞計數(Neu)、淋巴細胞計數(Lym)、異型淋巴細胞占比、C反應蛋白、降鈣素原。

2 結 果

2.1兩組患兒臨床資料及實驗室檢查結果比較 IM組患兒肝大及脾大占比、Neu、Lym、異型淋巴細胞占比，以及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平均顯著高于非IM發(fā)熱組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患兒臨床資料及實驗室檢查結果比較

2.2IM相關指標的Logistic回歸分析 根據單因素分析結果，將IM患病作為因變量(1=是，0=否)；將肝大(1=是，0=否)及脾大(1=是，0=否)、Neu(實測值)、Lym(實測值)、異型淋巴細胞占比(實測值)、TNF-α(實測值)、IL-1β(實測值)、IL-6(實測值)及IL-10(實測值)作為自變量進行二元Logistic回歸分析，結果顯示，肝大(OR=35.128，95%CI：4.467～127.556)、異性淋巴細胞占比(OR=1.277，95%CI：1.021～1.476)、TNF-α(OR=15.991，95%CI：5.476～369.052)、IL-1β(OR=2.015，95%CI：1.095～3.706)、IL-6(OR=2.853，95%CI：1.398～5.822)及IL-10(OR=1.221，95%CI：1.083～1.377)為IM的危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 IM相關指標的Logistic回歸分析

2.3基于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的預測模型的構建與驗證 根據多因素Logistic分析結果，構建基于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的預測列線圖，見圖1。列線圖預測IM的C指數為0.922(95%CI：0.871～0.963)。內部驗證顯示，列線圖模型預測IM與實際可能性絕對誤差為0.009，一致性良好，見圖2。

圖1 基于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平預測IM的列線圖

圖2 基于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平預測IM模型的內部驗證

3 討 論

國內IM發(fā)病人群主要集中于學齡及學齡前兒童，IM是一類自限性疾病，患兒癥狀會在一定時間后消失，但在SENJO等[8]的研究中，少部分臨床治愈后的患兒淋巴組織內仍有少量EB病毒殘留，而此類殘留病毒會誘發(fā)小兒惡性腫瘤疾病。通過早期確診并采取積極的治療手段能盡可能地在病毒復制早期進行遏制，并減少治愈后的病毒殘留量。目前，根據《諸福棠兒科學(第八版)》中的描述，通過癥狀及相關抗原的檢測能對IM進行有效診斷，但大部分發(fā)熱患兒首診的鄉(xiāng)村衛(wèi)生院及社區(qū)醫(yī)院等基層醫(yī)療機構開展相關抗原檢測的難度大。本課題組在前期的研究中，針對EB病毒所致的IM誘發(fā)的單核-巨噬細胞系統(tǒng)增生的特點，結合國內外多個研究[9-10]，篩選出了TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10對IM進行聯合診斷，效果顯著。

本研究中，單因素分析結果顯示，IM組患兒較非IM發(fā)熱組患兒肝大、脾大占比，以及Neu、Lym、異型淋巴細胞占比升高明顯。IM患兒的診斷標準中肝大是其中重要的一項標準，而劉立飛等[11]的研究中，IM患兒肝大、脾大占比高達62.1%及80.6%，顯著高于本次研究中的27.6%及78.7%，原因在于本研究主要針對早期發(fā)熱的IM患兒，納入患兒熱程均<3 d，而該研究中患兒熱程在7～10 d，由于此時間段內肝、脾二器官受到病毒感染的影響時間長，其所致的免疫功能異?？哼M更嚴重，故肝大、脾大更明顯。而咽峽炎及頸部淋巴結腫大在細菌或其他病毒所致的上呼吸道感染中也屬較為常見的癥狀，并非IM患兒的特異性表現，故這些癥狀僅為IM診斷參考標準中的一項。IM患兒的Neu、Lym及異型淋巴細胞占比明顯升高則是由于EB病毒引起的單核-巨噬細胞系統(tǒng)異常激活所致，這點也已經在國內外多個研究中得到證實[12-13]。TNF-α是由巨噬細胞釋放的腫瘤細胞殺傷因子，IM患者由于EB病毒感染導致巨噬細胞增生，故TNF-α水平亦會明顯增加。在肖楠陽等[14]的研究中，EB病毒感染患兒外周血單個核細胞(PBMC)內多個Toll受體蛋白及TNF-α mRNA均呈高表達狀態(tài)，而該研究還指出Toll受體蛋白是前炎性細胞因子基因激活的重要影響因素，說明EB病毒可導致PBMC內TRL激活，從而誘導TNF-α大量釋放，本研究中IM患兒的血清TNF-α水平顯著上升，與該研究結論一致。IL-1β、IL-6及IL-10均為IL家族成員，既往研究顯示，上述3種因子由T淋巴細胞釋放，IL-1β、IL-6具有促炎作用，而IL-10則具有抗炎作用，當EB病毒進入體內后，通常由巨噬細胞吞噬并將抗原信號呈遞至T細胞，從而誘導免疫反應的發(fā)生[15-16]。在GERBER-MORA等[17]的研究中，EB病毒感染后患兒體內CD4+CD8+調節(jié)性T細胞(Tr細胞)比例顯著上升，從而導致該細胞分泌的IL-10及IL-6水平顯著增加。同時文獻[14]報道，EB病毒激活TRL受體后亦會導致PBMC內的IL-1β mRNA水平顯著增加，從而導致體內上述因子水平增加，本研究也得到了類似結果。

回歸分析結果顯示，脾大、Neu、Lym與IM發(fā)病無相關性，筆者認為有以下幾點原因：(1)大規(guī)模流行病學調查結果顯示，近年來小兒上呼吸道感染中病毒感染的占比顯著增加，而巨細胞病毒、甲型流感病毒在某些特定條件下亦會誘發(fā)脾大，故脾大非EB病毒感染的特異性癥狀[18]；(2)在文獻[11]的研究中，患兒癥狀與年齡相關，部分年齡較小的患兒癥狀不典型；(3)發(fā)熱患兒多伴有病原體感染，而此類患兒Neu及Lym通常情況下會上升，加之病程較短，故上述2個指標差異不顯著；(4)本次研究為單中心小樣本量研究，結果可能存在偏倚。

列線圖是一種圖形工具模型，最初設計用于無需計算機或計算器即可快速地進行近似復雜的計算，通過將不同指標按其權重形成量化的預測分值，列線圖在提高單項指標診斷準確性的基礎上，具有簡便的界面和實用性，目前已被廣泛應用于疾病診斷及預后預測中[19-21]。本研究對基于TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平的列線圖分析結果顯示，C指數為0.922，提示該模型對于IM的預測價值較好。

綜上所述，TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10聯合檢測可以有效提升IM患兒的診斷效能，且ELISA檢測上述指標的可行性較好，可以應用于基層醫(yī)院發(fā)熱患兒IM的早期診斷中。