常彥斌，游靈玲，張曉兵

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科,重慶 400016

銅綠假單胞菌(PA)是醫(yī)院內感染和呼吸機相關性肺炎最常見的細菌[1-5]。PAⅢ型分泌系統(tǒng)(T3SS)的發(fā)現(xiàn)是細菌致病機制研究的突出進展，其T3SS主要分泌4種毒力蛋白，即胞外酶(Exo)S、ExoT、ExoY、ExoU，細菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)的導管裝置把T3SS毒力因子注入細胞，誘導細胞壞死、凋亡[6-10]。

據(jù)報道，群體感應(QS)系統(tǒng)抑制劑能減弱PA的毒力[11]，阿奇霉素能夠影響PA的QS系統(tǒng)信號分子[12-13]。本研究中，選擇對PA毒力機制更為關鍵的毒力基因exoS和exoU作為研究對象[14-15]，通過PCR分析細菌T3SS毒力基因exoS和exoU的分布。用K-B紙片法研究細菌耐藥情況，選取exoS、exoU陽性株通過RT-PCR方法研究阿奇霉素對銅綠假單胞菌exoS、exoU mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1菌株來源 從本實驗室自2010-2019年保存的臨床菌株庫中隨機選擇50株PA，其中38株來自痰液，6株來自尿液，5株來自分泌物，1株來自血液。使用VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定所有菌株到種。

1.2抗菌藥物藥敏試驗 通過K-B法測定PA對10種抗菌藥物的耐藥率。藥敏紙片：頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、慶大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南均為英國Oxoid公司產品。MH培養(yǎng)基由重慶龐通醫(yī)療器械有限公司提供。

1.3exoS、exoU基因檢測 以煮沸法制備細菌總DNA。用PCR方法檢測exoS、exoU基因。依據(jù)exoS(GenBank no.AE004091)和exoU(GenBank no.AAC16023)的完整基因序列，采用Primer 3 Plus在線軟件設計引物，引物由上海生工生物公司合成。引物序列見表1。各靶基因PCR擴增體系：10 μmol/L上、下游引物各1.25 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5×PCR反應緩沖液5 μL，DNA聚合酶 0.25 μL，總反應體積25 μL(其中模板5 μL)，其余用雙蒸水補足至25 μL。PCR檢測exoS熱循環(huán)參數(shù)：93 ℃預變性5 min，然后93 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR檢測exoU熱循環(huán)參數(shù)：93 ℃預變性5 min，然后93 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。對PCR擴增產物進行2.00%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外凝膠電泳成像儀下觀察，并記錄結果。

表1 PCR引物序列及預計產物長度

1.4阿奇霉素處理細菌 T3SS毒素誘導培養(yǎng)基[16]：胰蛋白胨(Tryptone) 10 g，酵母浸膏粉(Yeast extract) 5 g，氯化鈉(NaCl) 10 g，乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)1.902 g溶于1 L蒸餾水，調節(jié)pH值至7.0，高壓(1.034×105Pa)滅菌20 min。隨機選擇exoS、exoU陽性菌株各1株，在LB培養(yǎng)基中37 ℃水浴震蕩培養(yǎng)過夜，次日取0.1 mL菌液加入含不同藥物濃度的誘導培養(yǎng)基5 mL中37 ℃水浴震蕩6～8 h，細菌生長OD600為0.6～1.0，取1.0 mL菌液加入1.5 mL無菌離心管，6 000 r/min離心5 min，收集細菌。

1.5RT-PCR檢測exoS、exoU mRNA相對表達水平 細菌總RNA的提取參照EZgeneTMbacterial RNA Kit(Biomiga公司)操作說明進行。RT-PCR試劑盒mRNA selective PCR Kit(特異擴增mRNA)購自TaKaRa公司。依據(jù)exoS(GenBank no.AE004091)和exoU(GenBank no.AAC16023)的編碼序列，用Primer 3 Plus在線軟件設計RT-PCR引物，引物由上海生工生物公司合成。引物序列見表2。

表2 RT-PCR引物序列及預計產物長度

對PCR擴增產物進行2.00%瓊脂糖凝膠電泳。將電泳凝膠置于凝膠圖像分析系統(tǒng)，照相后，采用Gel-Pro(USA)凝膠圖像分析軟件分析處理。PCR產物量以積分光密度(IOD)表示擴增產物量，計算各mRNA與16S rRNA的比值，即為該mRNA的相對表達水平。

1.6統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.150株PA臨床株exoS、exoU基因的攜帶情況 PCR檢測50株臨床分離PA exoS、exoU基因，結果exoS基因檢測在573 bp有條帶，部分菌株PCR產物的電泳結果見圖1，隨機選擇1株PCR陽性株進行擴增出的測序和比對結果見圖3；exoU基因檢測在428 bp有條帶，部分菌株PCR產物的電泳結果見圖2，隨機選擇1株PCR陽性株進行擴增出的測序和比對結果見圖4。50株PA兩種毒力基因的分布情況見表3。

表3 50株銅綠假單胞菌兩種毒力基因分布(株)

注：M為DNA Marker；1、3、5泳道為exoS基因陽性PA臨床株；2、4、6泳道為exoS基因陰性PA臨床株。

圖3 PA臨床株exoS PCR擴增的基因測序和序列比對圖

圖4 PA臨床株exoU PCR擴增的基因測序和序列比對圖

2.2exoS與exoU陽性PA臨床株對常用抗菌藥物耐藥情況 用K-B法分析exoS與exoU陽性PA對10種抗菌藥物耐藥情況，結果見表4。從結果可以看出exoU陽性PA對10種抗菌藥物的耐藥率均高于exoS陽性株，其中環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 exoS與exoU陽性的兩組PA對常用抗菌藥物耐藥率[n(%)]

注：M為DNA Marker；1、2、3、5、6泳道為exoU基因陰性PA臨床株；泳道4為exoU基因陽性PA臨床株。

2.3不同濃度阿奇霉素對exoS mRNA相對表達水平的影響 用微量肉湯稀釋法測得exoS 基因陽性的PA阿奇霉素最低抑菌濃度(MIC)為64 μg/mL，用0 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL的阿奇霉素作用于exoS基因陽性的PA臨床分離株。在實驗中未觀察到這些濃度的阿奇霉素對細菌生長的影響，通過RT-PCR檢測exoS mRNA的相對表達水平，結果顯示，exoS mRNA的相對表達水平在阿奇霉素4 μg/mL時最高，當阿奇霉素濃度增加時，exoS mRNA逐漸下降至空白對照水平。見表5。

2.4不同濃度阿奇霉素對exoU mRNA相對表達水平的影響 用微量稀釋法測得exoU 基因陽性的PA阿奇霉素MIC為128 μg/mL，用0 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL的阿奇霉素作用于exoU 基因陽性的PA臨床分離株。在實驗中未觀察到這些濃度的阿奇霉素對細菌生長的影響，通過RT-PCR檢測exoU基因mRNA相對表達水平，阿奇霉素作用exoU 基因陽性的PA后exoU mRNA表達持續(xù)降低。見表5。

表5 不同濃度阿奇霉素作用于exoS基因陽性PA后exoS基因mRNA相對表達水平

3 討 論

PA是一種在環(huán)境中普遍存在的革蘭陰性桿菌，是院內感染和呼吸機相關性肺炎最常見病原菌之一，而抗菌藥物的使用及濫用使細菌的耐藥性逐漸增加，并且由于細菌毒力因子的釋放[17]，許多重癥肺炎患者只用敏感抗菌藥物，所以往往不能改善疾病持續(xù)時間和嚴重程度[18]。隨著人們對細菌毒力機制理解的深入，毒力因子逐漸成為治療細菌感染的新靶位。近幾年發(fā)現(xiàn)，T3SS廣泛存在于PA中，與細菌的毒力機制密切相關。PA T3SS主要分泌4種毒力因子：exoS、exoT、exoU、exoY，通過T3SS的導管裝置可將毒力因子轉運至宿主細胞的細胞質，麻痹宿主細胞以促進PA感染[19]。PA T3SS 毒力因子介導組織損傷、抑制傷口愈合，對PA的感染至關重要[19]。本文研究了50株PA T3SS毒力基因 exoS和exoU的分布情況，結果顯示72.00%菌株攜帶exoS基因，28.00%的攜帶exoU基因，無同時攜帶兩種基因的菌株，與文獻[20]報道類似。

本研究結果還顯示，exoU陽性PA株多為多重耐藥菌，比exoS陽性株有更高的耐藥性，這可能與exoU陽性株細胞膜上外排泵表達水平更高有關[21-22]。有文獻報道，PA exoU陽性對喹諾酮類抗菌藥物耐藥性明顯高于exoS陽性株[21]，這是由于藥物靶位gyrA突變和外排泵過表達引起。但本研究中exoU陽性株只有14株，數(shù)量上遠遠少于exoS陽性株的36株，這些數(shù)量上的差異是否對本研究結果造成的誤差，有待今后增加檢測菌株數(shù)量后進一步確定。

大環(huán)內酯類抗菌藥物通常不是抗PA的抗菌藥物，然而近年來研究表明，大環(huán)內酯類抗菌藥物在治療PA感染的囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病和彌散性全細支氣管炎患者中有良好效果[23-24]，其具體機制可能是大環(huán)內酯類抗菌藥物具有一定的抗炎[25]和抗細菌毒力作用[13]。有研究表明，阿奇霉素是通過抑制lasI/lasR和rhlI/rhlR基因的轉錄，進一步抑制毒力因子的產生[13,26]。本文通過RT-PCR分析了阿奇霉素對試驗菌株毒力基因exoS和exoU mRNA表達的作用，結果表明低濃度阿奇霉素對exoS mRNA的表達有促進作用,阿奇霉素濃度為4 μg/mL時菌株exoS mRNA的相對表達水平最高，隨著藥物濃度的增加，exoS mRNA的相對表達水平逐漸降低，而阿奇霉素對exoU mRNA的表達有抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素可以抑制PA大部分毒力基因的表達，并抑制細菌生物膜的形成[13]，但本文研究發(fā)現(xiàn)低濃度阿奇霉素具有促進exoS mRNA表達，而抑制exoU mRNA表達的作用，因此，與感染exoS陽性菌株患者相比，阿奇霉素可能對感染exoU陽性株的患者更有益。值得注意的是，低劑量阿奇霉素具有促進PA exoS mRNA表達作用，提示臨床針對相應感染患者抗感染治療時應嚴格按照規(guī)范服用該藥，以便快速達到有效濃度，并在有效濃度范圍維持足夠時間。