于明洲，吳函書，冷 瀛

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六五醫(yī)院眼科，吉林吉林 132011;2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，吉林吉林 132011

增殖型糖尿病性視網(wǎng)膜病變(PDR)中，異常新生的血管和結(jié)締組織可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離并危及視力。有研究發(fā)現(xiàn)，PDR中眼組織的新血管形成與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平密切相關(guān)[1]。目前，PDR的標(biāo)準(zhǔn)治療方法都集中在PDR的晚期，并存在潛在不良反應(yīng)[2-3]。丙戊酸(VPA)是一種能夠抑制細胞增殖的組蛋白去乙酰化酶抑制劑[4]。有研究報道，VPA能夠抑制內(nèi)皮細胞的增殖及血管新生[5-6]。本研究通過觀察VPA對VEGF條件下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(HRMECs)的影響，以期為PDR的治療找到新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 HRMECs購自北京裕恒豐科技有限公司，RPMI 1640細胞培養(yǎng)液及胎牛血清購自Hylcone公司(美國)，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 mol/L，pH 7.4)購自武漢博士德生物公司，VPA購自Sigma公司(美國)，VEGF購自PeproTech公司(美國)，CCK8試劑盒購自南京碧云天生物技術(shù)研究所，基質(zhì)膠購自BD公司(美國)，遷移小室(Transwell)及胰酶購自Millipore公司(美國)，BCA蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物公司，兔抗人磷酸化-血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(p-VEGFR2)、磷酸化-絲氨酸/蘇氨酸激酶(p-AKT)、磷酸化-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)購自CST公司(美國，貨號2478T、4060T、4370T)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)HRMECs，置于5%CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞增殖能力檢測 將對數(shù)生長期的HRMECs用0.25%的胰酶消化下來制成細胞懸液，并接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞懸液200 μL，細胞濃度1×104個/孔。設(shè)置細胞對照組、試劑對照組、VPA處理組(VPA終濃度分別為10、20、40、80、160 μmol/L)，每孔均含VEGF 10 ng/mL。在5% CO2、37 ℃孵箱中分別孵育24 h和48 h，處理與培養(yǎng)結(jié)束后，各孔分別加入10 μL CCK8試劑，輕輕搖晃混勻，4 h內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下各孔的吸光度(A)值，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(AVPA處理組-A試劑對照組)/(A細胞對照組-A試劑對照組)]×100%。

1.2.3細胞遷移能力檢測 將處理后的各組HRMECs用胰酶消化，用RPMI 1640細胞培養(yǎng)液制成單細胞懸液，Transwell上室內(nèi)接種濃度為5×104個/孔的HRMECs。Transwell下室內(nèi)加入10%胎牛血清的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基及終濃度為50 ng/mL的VEGF共600 μL。經(jīng)20 h共培養(yǎng)后取出Transwell小室，棄去上室培養(yǎng)液，上室內(nèi)未遷移的細胞用棉簽擦去，PBS洗3遍。95%的乙醇固定膜下表面細胞，取下Transwell小室膜，經(jīng)結(jié)晶紫染色后置于載玻片上用中性樹膠封片。在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察遷移細胞的數(shù)量，隨機選取5個視野計數(shù)，計算平均遷移細胞數(shù)。

1.2.4細胞體外成管能力檢測 在冰上將預(yù)先4 ℃過夜融化的基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基(含100 ng/mL的VEGF)按1∶1混合加入預(yù)冷的24孔板，每孔300 μL， 然后置于37 ℃孵育1 h使其成膠。將處理好的各組HRMECs用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基制成單細胞懸液，HRMECs以5×104個/孔的密度接種于預(yù)置基質(zhì)膠的24孔板內(nèi)，37 ℃孵育24 h，在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機選取3處管腔密集處計數(shù)。

1.2.5蛋白表達檢測 收集處理好的各組HRMECs，每組加入裂解液(RIPA裂解液與PMSF以100∶1的比例配制)100 μL，用移液槍反復(fù)吹打使細胞與裂解液充分接觸，冰上靜置30 min，低溫離心機中4 ℃、10 000 r/min離心15 min后，將上清液移至新的EP管中。用BCA法定量各組上清液中蛋白質(zhì)濃度。在恒壓條件下采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后以250 mA恒定電流將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。PVDF膜放入5%的脫脂牛奶中37 ℃下封閉3 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗滌3次，加入二抗37 ℃孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，采集圖像，用Quantity One圖像分析軟件測定灰度值。

2 結(jié) 果

2.1VPA對VEGF誘導(dǎo)的HRMECs增殖能力的影響 CCK8實驗結(jié)果顯示，A值隨著VPA濃度的增高而減小，提示隨著VPA濃度增高活細胞數(shù)減少，并且隨著VPA作用時間的增加，其對HRMECs的增殖抑制增強，見圖1。結(jié)果表明，VPA能夠抑制HRMECs的增殖，且VPA在0～160 μmol/L的濃度范圍內(nèi)與HRMECs的增殖能力呈負相關(guān)。VPA處理 24 h和48 h的半效抑制濃度(IC50值)分別為160.37 μmol/L和78.95 μmol/L。因此，在后續(xù)實驗中以作用時間48 h、濃度40 μmol/L作為VPA處理方式(VAP處理組)，以不加藥物的HRMECs作為對照組。

圖1 VPA對VEGF誘導(dǎo)的HRMECs增殖能力的影響

2.2VPA對VEGF誘導(dǎo)的HRMECs遷移能力的影響 Transwell小室遷移實驗結(jié)果顯示，HRMECs經(jīng)40 μmol/L VPA處理48 h后，穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果表明HRMECs的遷移能力明顯降低，見圖2，提示VPA能抑制VEGF誘導(dǎo)的HRMECs細胞遷移。

2.3VPA對VEGF誘導(dǎo)的HRMECs體外成管能力的影響 基質(zhì)膠體外成管能力實驗結(jié)果表明，HRMECs經(jīng)40 μmol/L VPA處理48 h后，HRMECs在基質(zhì)膠上形成的管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。結(jié)果提示，VPA能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的HRMECs體外形成管腔的能力。

注：A為對照組；B為VPA處理組；C為兩組定量分析結(jié)果；與對照組比較，*P<0.05。

2.4VPA對HRMECs蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果表明，VEGF組較對照組p-VEGFR2、p-AKT以及p-ERK1/2的蛋白水平均有升高，而HRMECs經(jīng)40 μmol/L VPA處理48 h后，細胞中VEGF介導(dǎo)的信號通路相關(guān)蛋白的水平發(fā)生變化。其中，p-VEGFR2及其下游的p-AKT及p-ERK1/2的蛋白水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。結(jié)果表明，VPA能引起存在于內(nèi)皮細胞表面的VEGFR2磷酸化水平降低，以及降低內(nèi)皮細胞增殖及遷移相關(guān)蛋白AKT、ERK1/2的磷酸化水平。

注：A為 Western blot檢測蛋白表達結(jié)果；B為蛋白定量分析結(jié)果；與對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

糖尿病性視網(wǎng)膜病變是糖尿病性微血管病變中最重要的表現(xiàn)，PDR中新生血管生長影響并通過多種因素導(dǎo)致嚴重視力下降，甚至完全失明。血管新生是一個由內(nèi)皮細胞構(gòu)成新血管的復(fù)雜過程。血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細胞遷移、內(nèi)皮細胞增殖、內(nèi)皮細胞管道化分支形成血管環(huán)等步驟是血管生成的主要過程[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；敢种苿￢PA明顯抑制了VEGF誘導(dǎo)的HRMECs增殖，并且這種抑制能力于一定的時間和劑量范圍內(nèi)呈正相關(guān)。此外，VPA也能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的HRMECs細胞體外成管及細胞遷移。以上結(jié)果表明，VPA具有抑制VEGF引起的HRMECs血管新生作用。

VEGF水平在很大程度上影響糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者眼組織新血管形成。高葡萄糖水平對血管內(nèi)皮細胞的損害作用引起一些血管閉塞導(dǎo)致缺氧和局部缺血[8]。而通過缺氧產(chǎn)生的低氧誘導(dǎo)因子-1誘導(dǎo)的VEGF是眼新血管形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，并且在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞和周細胞上存在高親和力的VEGF受體[9-10]。VEGF是一類由細胞產(chǎn)生的能夠引起血管生成的信號蛋白，它與生理狀態(tài)下及病理狀態(tài)下的血管新生有著密切聯(lián)系[11]。過度表達的VEGF可能引起視網(wǎng)膜和身體其他部位的血管疾病。VEGF與周圍血管壁靜止內(nèi)皮細胞表面的VEGFR2結(jié)合，觸發(fā)內(nèi)皮激活和下游血管生成的信號通路[12]。當(dāng)VEGF與內(nèi)皮細胞膜上的VEGFR2結(jié)合，引起受體自身磷酸化，從而進一步引發(fā)內(nèi)皮細胞中AKT和ERK的磷酸化，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增生，進而引起一系列的血管生成進程[13]。此外，VEGFR2介導(dǎo)的AKT和ERK的磷酸化對內(nèi)皮細胞的遷移能力具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[14-15]。因此，VEGF對新生血管形成的促進作用可能是通過磷酸化VEGFR2進而引起下游AKT、ERK的磷酸化水平增高來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VPA能夠抑制HRMECs的增殖、遷移及體外成管能力，VPA能夠降低VEGF誘導(dǎo)的p-VEGFR2、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白水平。因此，可以推測VPA對HRMECs增殖、遷移及成管能力的抑制可能是通過下調(diào)VEGF誘導(dǎo)的p-VEGFR2、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白水平來實現(xiàn)的。

組蛋白去乙?；敢种苿￢PA能夠在體外抑制VEGF誘導(dǎo)的HRMECs的增殖、遷移及成管能力，其可能的機制為VPA抑制了VEGF介導(dǎo)的VEGFR2磷酸化水平及其下游AKT/ERK信號通路。