王少鑫，崔立紅，李曉偉，劉新堯，羅 哲，閆志輝

(解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 消化內(nèi)科， 北京 100048)

UBE2W[ubiquitin-conjugating enzyme (E2)W]是一種新型泛素結(jié)合酶(E2)，催化泛素化過程，在人和鼠組織中均有表達(dá)[1-2]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)UBE2W參與了核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控[3]，而NF-κB通路作為一種重要的信號傳導(dǎo)樞紐，在炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖、凋亡在內(nèi)的多種生物學(xué)效應(yīng)中均發(fā)揮作用，是細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號通路之一[4-6]。由此推測UBE2W可能通過調(diào)控NF-κB通路在炎性反應(yīng)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本研究中采用小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型模擬炎性反應(yīng)過程，探討UBE2W在葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及動物：小鼠成纖維細(xì)胞系L929(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家生物醫(yī)學(xué)分析中心)。C57BL/6雄性小鼠，約6周，共10只，體質(zhì)量約20 g(北京唯尚立德生物公司，SPF級，無菌環(huán)境中飼養(yǎng))。

1.1.2 試劑：轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司)；小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑(英格恩生物有限公司)；葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS, MW:36～50 ku)(MP生物醫(yī)藥公司);UBE2W siRNA 1#-3#(廣州銳博生物公司合成)，靶序列分別為siRNA 1#：5′-GTGGATCGTAGACATGGAA-3′, siRNA 2#：5′-GTAGTCGATACCCTTTTGA-3′，siRNA 3#：5′-CGACTACAAAAAGAACTGT-3′。 UBE2W抗體(Thermo Fisher Scientific公司)；GAPDH抗體(銳爾康生物科技公司)；PCR檢測試劑盒(TaKaRa公司)；Q-PCR引物(Invitrogen公司合成)。具體序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 Western blot檢測UBE2W蛋白：小鼠成纖維細(xì)胞L929于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種植于12孔培養(yǎng)皿中，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNA iMAX共轉(zhuǎn)，染2次sicontrol/siUbe2w(50 nmol/L)48 h后收集細(xì)胞。然后， 將裂解緩沖液加入混勻后， 沸水浴變性10 min；冷卻至室溫后進(jìn)行Western blot，主要包括電泳、轉(zhuǎn)印、孵育抗體及顯影過程。 一抗為抗UBE2W兔多抗(1∶500)，肌動蛋白鼠單抗(1∶1 000)為內(nèi)參。

結(jié)腸組織行Western blot檢測：將液氮凍存的結(jié)腸組織放置預(yù)冷的研缽中研磨, 待組織成粉末狀后，加入等量2×蛋白質(zhì)緩沖液，沸水浴變性再冷卻后按上述方法行Western blot。

1.2.2 構(gòu)建小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型：將10只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為2組，分別在第0、4和8天分3次尾靜脈注射siRNA，進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染siUbe2w和si-control(2.5 mg/kg)，根據(jù)轉(zhuǎn)染siRNA不同，分別為siUbe2w組和si-control組。其轉(zhuǎn)染的siRNA與轉(zhuǎn)染試劑按2∶1比例配備稀釋液進(jìn)行鼠尾注射，每只鼠尾注射液為200 μL，包括核酸稀釋液100 μL(siRNA 和10%葡萄糖各50 μL)、轉(zhuǎn)染試劑稀釋液100 μL(轉(zhuǎn)染試劑25 μL和10%葡萄糖50 μL，余純水補(bǔ)足)。在實驗第3天開始飲用2.5% DSS濃度，給藥5 d后飲用普通飲用水，小鼠恢復(fù)4 d后被處死，第13天實驗結(jié)束。建模結(jié)束時取小鼠全結(jié)腸固定于10%甲醛溶液中，同時取材部分小鼠結(jié)腸組織分別置于1 mL Trizol和RNAlater(組織保存試劑)中液氮保存。

1.2.3 RT-qPCR檢測mRNA：將RNAlater保存的小鼠結(jié)腸組織從液氮取出，在預(yù)冷的研缽中研磨至粉末狀，然后進(jìn)行RT-qPCR實驗。主要包括提取總RNA、cDNA合成、反轉(zhuǎn)錄PCR 3部分，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s的步驟,40個循環(huán)。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.2.4 潰瘍性結(jié)腸炎性反應(yīng)評價指標(biāo)：在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎建模過程中每日測量小鼠體質(zhì)量(g)，計算體質(zhì)量變化(每日體質(zhì)量/初始體質(zhì)量)%。組織學(xué)評價：以HE(hematoxylin-eosin)染色全結(jié)腸中所見潰瘍數(shù)目評分與潰瘍范圍評分之和作為組織學(xué)評分[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 L929細(xì)胞中UBE2W 的蛋白表達(dá)

在L929細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siUbe2w，與對照組相比，轉(zhuǎn)染后3個干擾序列siRNA的UBE2W蛋白表達(dá)均有不同程度的抑制，其中siRNA 2#干擾序列的Ube2w敲低效果最佳，選作后續(xù)體內(nèi)轉(zhuǎn)染干擾序列(圖1)。

*P<0.05 compared with si-control group

2.2 兩組小鼠潰瘍性結(jié)腸炎組織Ube2w mRNA和蛋白水平比較

Ube2w敲低組小鼠結(jié)腸組織中Ube2wmRNA表達(dá)水平相對于對照組0.35±0.02，明顯降低(n=5，P<0.05)。敲低組UBE2W蛋白表達(dá)亦明顯低于對照組，因此，siUbe2w體內(nèi)轉(zhuǎn)染后，敲低組小鼠結(jié)腸組織中UBE2W mRNA和蛋白水平明顯受抑制(圖2)。

*P<0.05 compared with control group

2.3 UBE2W對兩組結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量變化的影響

結(jié)腸炎過程中，敲低組小鼠體質(zhì)量下降較對照組明顯，第11天敲低組小鼠體質(zhì)量丟失至初始體質(zhì)量的76%左右，而對照組體質(zhì)量丟失為85%左右(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group

2.4 兩組結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜病理組織學(xué)比較

小鼠全結(jié)腸進(jìn)行組織學(xué)HE染色，敲低組小鼠潰瘍性結(jié)腸炎組織中結(jié)腸黏膜表面的潰瘍數(shù)目明顯多于對照組，且潰瘍范圍更大，即黏膜炎性反應(yīng)比對照組更嚴(yán)重。敲低組小鼠的結(jié)腸炎組織學(xué)評分為(8.60±0.24)分，明顯高于對照組(5.20±0.49)分(P<0.05)(圖4)。

Arrow.the ulcer or ulcer range; *P<0.05 compared with control group

3 討論

在炎性反應(yīng)、化學(xué)刺激、環(huán)境變化等應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)下，可能出現(xiàn)包括NF-κB信號通路在內(nèi)的各種信號通路的失調(diào)，而在不同通路激活過程中，需要泛素化磷酸化等多種蛋白質(zhì)修飾過程參與[8]。

UBE2W作為一種新型泛素結(jié)合酶，催化泛素與靶蛋白的結(jié)合，通過泛素化過程，參與了信號傳導(dǎo)和DNA損傷等多種生物學(xué)過程。目前研究發(fā)現(xiàn)，UBE2W可能參與了CHIP和PHD的單泛素化，還可能通過對FA-BRCA通路的調(diào)控，與細(xì)胞分裂相關(guān)[9-11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，UBE2W在DNA損傷反應(yīng)中并不發(fā)揮重要作用，只在Rnf4缺乏的情況下可能加重DNA損傷[12]。但目前為止，關(guān)于UBE2W的生物學(xué)功能研究仍鮮有報道。前期研究發(fā)現(xiàn)UBE2W參與調(diào)控了NF-κB轉(zhuǎn)錄活性[3]，而NF-κB通路是最主要與炎性反應(yīng)相關(guān)的信號通路之一，參與調(diào)控了包括炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖、凋亡在內(nèi)的多種生物學(xué)過程[4,9]。由此設(shè)想UBE2W可能參與了炎性反應(yīng)的調(diào)控。為驗證這種假設(shè)，本研究選擇DSS小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型模擬炎性反應(yīng)過程，通過建立對照組和Ube2w敲低組結(jié)腸炎小鼠，觀察不同組小鼠潰瘍性結(jié)腸炎性程度變化，進(jìn)而探討UBE2W對結(jié)腸炎性反應(yīng)的影響。

結(jié)腸炎是由多種病因綜合作用所致的炎性反應(yīng)病變，可能涉及包括免疫、遺傳、環(huán)境和感染等。葡聚糖硫酸鈉鹽(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎性反應(yīng)很好的模擬了慢性腸道炎性反應(yīng)過程，現(xiàn)已成為經(jīng)典結(jié)腸炎動物模型，廣泛用于實驗研究中[13]。

本研究中選擇DSS模型模擬小鼠的炎性反應(yīng)過程，兩組小鼠在造模過程中出現(xiàn)不同程度的消瘦、腹瀉等表現(xiàn)，結(jié)合組織學(xué)表現(xiàn)，選擇體質(zhì)量變化和組織學(xué)評分評價DSS結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度和易感性。本研究結(jié)果表明，Ube2w敲低組小鼠在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中體質(zhì)量丟失更多、結(jié)腸黏膜組織損傷更為明顯，因此推測UBE2W參與了炎性反應(yīng)過程，Ube2w敲低后DSS小鼠潰瘍性結(jié)腸炎易感性增加。但目前關(guān)于UBE2W如何影響了結(jié)腸炎的進(jìn)展過程，以及調(diào)控機(jī)制仍不清楚，還有待進(jìn)一步研究。目前新近報道表明UBE2W下調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]，是否其在結(jié)腸炎進(jìn)展中也影響了結(jié)腸癌的發(fā)生，亦是尚待解決的課題，值得進(jìn)一步深入探討。