袁妮娜 樓響瑜 冷建杭

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是指發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，是我國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。在中國(guó)，NPC的高發(fā)區(qū)主要集中在廣東、廣西、湖南、福建和江西5省，其中以廣東省為高發(fā)，發(fā)病率在25/100 000～30/100 000[1]。迄今為止，NPC的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，有研究表明NPC可能由環(huán)境因素、遺傳因素以及EB病毒感染引起，遵循多基因-環(huán)境交互作用的模式[2-4]。然而，大部分遺傳因素方面的研究均集中于核基因，NPC和線(xiàn)粒體基因組的關(guān)系目前尚不清楚。線(xiàn)粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是一種細(xì)胞核外唯一的遺傳物質(zhì)，全長(zhǎng)為16，569-bp[5]。由于mtDNA缺乏組蛋白保護(hù)，因此對(duì)輻射等氧化損傷較為敏感。此外，mtDNA損傷修復(fù)能力低，可造成核酸片段缺失，其中線(xiàn)粒體4977-bp缺失最為常見(jiàn)[6-7]。線(xiàn)粒體4977-bp缺失位于線(xiàn)粒體序列13-bp的正向重復(fù)序列（5'-ACCTCCCTCACC-3'），即 8470～8482 和 13447～13459 之間[8]。本研究旨在分析線(xiàn)粒體4977-bp缺失對(duì)NPC的影響，并對(duì)攜帶該缺失的患者進(jìn)行線(xiàn)粒體功能分析，探討NPC發(fā)病的可能分子機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2019年1至12月在杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科手術(shù)的NPC患者66例，采集鼻咽纖維鏡活檢的腫瘤組織約50 mg，均經(jīng)病理確診。其中男44例，女22例；年齡22～61歲，中位年齡40歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 全基因組DNA提取 采用改進(jìn)的酚、氯仿、異戊醇提取法提取腫瘤組織中的DNA。首先將腫瘤組織放在1.5 ml離心管中，分別用75%和50%的乙醇和純水梯度脫乙醇，將組織放入研缽中，加入DNA裂解液；隨后將研磨好的組織液加入離心管，并加入10 μl的蛋白酶K，加入等體積的酚后離心，分為3層，吸取上層液，加入飽和酚、氯仿和異戊醇（比例為25:24:1）混合液后搖勻繼續(xù)離心，吸取上清液后加入等體積的氯仿和異戊醇混合液400 μl，離心后加入2.5倍體積的100%乙醇，冷凍過(guò)夜后將樣品取出12 000 r/min離心，白色沉淀物即為DNA。將所得的DNA溶于雙蒸水，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，并用紫外分光密度儀檢測(cè)所提取的DNA濃度。

1.3 線(xiàn)粒體4977-bp缺失檢測(cè) 采用巢式PCR檢測(cè)腫瘤組織中線(xiàn)粒體4977-bp缺失情況，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物序列見(jiàn)表1。其中外F和外R用于擴(kuò)增4977-bp缺失區(qū)域兩端較長(zhǎng)區(qū)域序列，內(nèi)F與內(nèi)R用于擴(kuò)增4977-bp缺失區(qū)域兩端較短區(qū)域序列。在PCR管中，加入Takara Taq酶0.1 μl，10×Buffer 2 μl，dNTP 2 μl，Mg2+1.5 μl，正反向引物各0.4 μl，模板 DNA 1.2 μl，加入去離子水至 25 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。第1次使用外引物進(jìn)行擴(kuò)增，第2次使用內(nèi)引物，模板為第1次PCR的產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl的PCR產(chǎn)物于加有溴化乙錠的1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表1 線(xiàn)粒體4977-bp缺失檢測(cè)的PCR引物序列

1.4 攜帶線(xiàn)粒體4977-bp缺失患者線(xiàn)粒體功能分析

1.4.1 mtDNA拷貝數(shù)分析 分別抽取2例攜帶線(xiàn)粒體4977-bp缺失患者（NPC-1和NPC-2）和2例性別、年齡相仿的健康體檢者外周靜脈血3 ml，提取基因組DNA。使用線(xiàn)粒體ND1基因來(lái)確定mtDNA的拷貝數(shù)，選用β-actin作為看家基因。其中，擴(kuò)增線(xiàn)粒體ND1基因和β-actin的引物序列見(jiàn)表2。使用熒光定量PCR法檢測(cè)mtDNA的拷貝數(shù)，95℃10 min預(yù)變性后，95℃變性15 s，60℃退火1 min（熒光檢測(cè)）共40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，隨后95℃變性15 s，60℃退火1 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，使用2-ΔΔCt法計(jì)算出拷貝數(shù)[9]。

表2 mtDNA拷貝數(shù)檢測(cè)所需的引物序列

1.4.2 線(xiàn)粒體ATP水平分析 采用Ficoll密度梯度離心法[10]分離NPC-1和NPC-2患者和2例健康體檢者的外周血單核細(xì)胞。ATP定量分析使用CellTiter-Glo發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒，方法如下：將CellTiter-Glo試劑直接加入攜帶4977-bp缺失患者和健康體檢者的單核細(xì)胞中，10 min后檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，細(xì)胞裂解產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)與ATP含量成正比[11]。

1.4.3 活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平分析由于ROS是線(xiàn)粒體產(chǎn)生的氧自由基，對(duì)細(xì)胞、組織和蛋白有一定的損傷作用，ROS的過(guò)量表達(dá)是線(xiàn)粒體功能損傷的指標(biāo)[12]。ROS的檢測(cè)基于一種熒光染料2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2',7'-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）的強(qiáng)度，DCFH-DA 本身沒(méi)有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成2',7'-二氯二氫熒光素（2',7'-Dichlorodi-hydrofluorescein，DCFH），和探針特異性結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無(wú)熒光的DCFH變成有熒光的2',7'-二氯熒光素（2',7'-Dichlorofluorescein，DCF），熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比，使用流式細(xì)胞儀計(jì)算熒光強(qiáng)度，計(jì)算ROS水平[13]。

2 結(jié)果

2.1 線(xiàn)粒體4977-bp缺失情況 巢式PCR法可以擴(kuò)增出358-bp的片段，而不含4977-bp缺失的個(gè)體，無(wú)法擴(kuò)增出358-bp的片段，見(jiàn)圖1。66例NPC患者中有2例攜帶線(xiàn)粒體4977-bp缺失（NPC-1和NPC-2），檢出率為3.03%。

圖1 線(xiàn)粒體4977-bp缺失的巢式PCR電泳圖[孔道1為空白對(duì)照，孔道2和3表示攜帶線(xiàn)粒體4977-bp缺失的樣本（NPC-1和NPC-2）]

2.2 mtDNA拷貝數(shù)分析 mtDNA拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，NPC-1和NPC-2的mtDNA拷貝數(shù)分別為161.5和167.0，遠(yuǎn)高于健康體檢者的70.6。

2.3 線(xiàn)粒體ATP水平分析 ATP水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NPC-1和NPC-2的ATP含量分別為57.0和63.0，明顯低于健康體檢者的140.66。

2.4 ROS定量分析 ROS定量分析發(fā)現(xiàn)，NPC-1和NPC-2患者的ROS水平分別為99.0、107.5 U/ml，明顯高于健康體檢者的45.6 U/ml。

3 討論

早在1956年，生物學(xué)家Warburg[14]在癌細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了一種稱(chēng)為“有氧糖酵解”現(xiàn)象，就是大多數(shù)癌細(xì)胞即使在有充分氧供應(yīng)的條件下仍主要通過(guò)糖酵解途徑而不是氧化磷酸化途徑來(lái)獲得ATP用于維持自身代謝及分裂增殖，同時(shí)產(chǎn)生大量乳酸代謝產(chǎn)物，該效應(yīng)也稱(chēng)為Warburg現(xiàn)象，為癌細(xì)胞線(xiàn)粒體功能障礙的研究奠定了基礎(chǔ)。

由于線(xiàn)粒體基因組缺乏保護(hù)性組蛋白，修復(fù)能力非常有限，本身又是產(chǎn)生ROS的主要場(chǎng)所，因此mtDNA的突變率遠(yuǎn)高于核DNA[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA的4977-bp缺失是一種較為常見(jiàn)的突變，在癌癥中尤為常見(jiàn)[16-17]。Guo等[18]對(duì)105例肝癌患者進(jìn)行了線(xiàn)粒體4977-bp缺失的篩查，發(fā)現(xiàn)有10個(gè)患者攜帶該大片段的缺失。Tan等[19]應(yīng)用PCR技術(shù)分析乳腺癌腫瘤組織中常見(jiàn)的4977-bp缺失，19例腫瘤標(biāo)本均未檢測(cè)到該缺失。沈慧等[20]對(duì)52例新鮮胃癌標(biāo)本的研究表明4977-bp缺失陽(yáng)性率為73.1%。從分子結(jié)構(gòu)上看，線(xiàn)粒體4977-bp的缺失位于核苷酸位點(diǎn)的8470～13446之間的區(qū)域，缺失區(qū)編碼 5 個(gè)線(xiàn)粒體 tRNA、A8、A6、CO3、ND3、ND4L、ND4和ND5。因此，4977-bp的大片段缺失會(huì)影響線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)和功能，引起線(xiàn)粒體功能損傷，但是具體的分子機(jī)制尚不清楚。

本研究中，筆者首先利用巢式PCR法對(duì)NPC患者進(jìn)行了線(xiàn)粒體4977-bp缺失的檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)2例NPC患者攜帶這個(gè)大片段的缺失，檢出率為3.03%；并對(duì)2例攜帶線(xiàn)粒體4977-bp缺失的NPC患者和2例健康體檢者進(jìn)行了線(xiàn)粒體功能研究，包括mtDNA拷貝數(shù)、ATP和ROS水平。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶4977-bp缺失NPC患者的mtDNA拷貝數(shù)和ROS明顯高于健康體檢者，而ATP水平明顯低于健康體檢者。筆者認(rèn)為mtDNA對(duì)很多致癌因素敏感，是ROS攻擊的主要目標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞受到外源性物質(zhì)的攻擊時(shí)，使得線(xiàn)粒體總呼吸的代償，導(dǎo)致mtDNA的拷貝數(shù)增高。在癌細(xì)胞缺氧的情況下，線(xiàn)粒體氧化磷酸化功能受到抑制，ROS水平急劇上升，但是超氧化物歧化酶由于酶的活性改變，清除能力下降，引起線(xiàn)粒體大片段的缺失[21]。此外，由于線(xiàn)粒體功能損傷，呼吸鏈合成受阻，導(dǎo)致ATP水平下降，進(jìn)而參與了NPC的發(fā)病進(jìn)程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體4977-bp缺失和NPC有關(guān)，很有可能是通過(guò)影響線(xiàn)粒體氧化磷酸化功能而參與了NPC的發(fā)病進(jìn)程，本研究為NPC的發(fā)病機(jī)制提供了新思路。本研究不足之處是標(biāo)本量較少，需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量來(lái)開(kāi)展后續(xù)的工作。