陳佳園 陳成帷 陳怡 余炳取 陳爍 張益光

結(jié)直腸癌是世界第四大致命性癌癥，每年約有90萬(wàn)人因結(jié)直腸癌死亡[1]。根據(jù)2015年中國(guó)癌癥數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌分別位居女性最常見(jiàn)癌癥的第4位和男性最常見(jiàn)癌癥的第5位[2]。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響因素很多，如吸煙、酗酒、過(guò)度肥胖、缺乏體育鍛煉、食用大量紅肉等[1，3-4]，但仍有很多患者并未暴露于這些危險(xiǎn)因素中，提示遺傳易感性在結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因重排、表觀遺傳修飾、異染色質(zhì)化等作用[5-6]，與影響癌癥易感性的各種生物學(xué)過(guò)程有關(guān)[7-8]。H19基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的lncRNA，位于人類染色體11p15.5上，包含4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子[9]。單核苷酸多態(tài)性可能影響基因表達(dá)和功能，增加癌癥易感性。有研究探索了H19基因rs2839698多態(tài)性與患癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系[6，10-13]，但不同類型癌癥的研究結(jié)果是相互矛盾的。Li等[12]發(fā)現(xiàn)H19基因rs2839698多態(tài)性會(huì)增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，故本研究對(duì)兩者的關(guān)系作進(jìn)一步探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2012年1月至2018年1月在浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院接受手術(shù)治療（術(shù)前未接受過(guò)放化療）的結(jié)直腸癌患者315例為病例組，同期在醫(yī)院體檢且性別、年齡均匹配的健康者441例為對(duì)照組，均為漢族。排除有癌癥或消化系統(tǒng)疾病家族史、其他來(lái)源轉(zhuǎn)移、放化療史的患者。病例組男60例，女255例；年齡（63.35±7.33）歲；BMI（25.18±1.45）kg/m2；有吸煙史204例；有飲酒史277例；有家族史44例；腫瘤直徑＞4 cm 165例，≤4 cm 150例；TNM分期：Ⅰ期67例，Ⅱ期90例，Ⅲ期93例，Ⅳ期65例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移133例；組織學(xué)分級(jí)：高分化32例，中分化248例，低分化35例；組織學(xué)分型：腺癌300例，鱗癌13例，其他2例；腫瘤位置：結(jié)腸癌113例，直腸癌202例。對(duì)照組男87例，女354例；年齡（62.50±7.33）歲；BMI（25.15±1.51）kg/m2；有吸煙史203例；有飲酒史220例。兩組對(duì)象性別、年齡、BMI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；在吸煙史、飲酒史比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患者人口學(xué)信息（性別、年齡、吸煙情況、飲酒情況、家族史等）以及腫瘤直徑、腫瘤位置、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理組織學(xué)分型等。

1.2.2 基因分型檢測(cè) 采集所有對(duì)象外周血2 ml，使用TIANAMP血液DNA試劑盒[DP348-03，200次，天根生化科技（北京）有限公司]提取外周血白細(xì)胞基因組DNA；使用 NanoDrop 3300（美國(guó) Thermo Scientific公司）在波長(zhǎng)260和280 nm處測(cè)定并提取DNA的質(zhì)量和濃度。本研究采用基于熒光的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法進(jìn)行基因分型，用于核苷酸延伸反應(yīng)的正向引物為CATCGTCCCCAGCTGATGTC，反向引物為GGAGTGATGACGGGGTGGAG；擴(kuò)增體系為25 μl反應(yīng)混合液，包括 1.25 μl基因分型 Assays（20×）、20 ng DNA、12.5 μl基因分型Master Mix（2×）。PCR條件：96 ℃ 5 min；96 ℃30 s，57 ℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。隨機(jī)抽查約10%的樣本進(jìn)行兩次分型，以保證基因分型的準(zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)評(píng)估對(duì)照組中實(shí)際頻數(shù)與預(yù)期頻數(shù)之間的偏差[14-15]。H19基因rs2839698多態(tài)性與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系采用logistic回歸分析，計(jì)算OR值及其95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H19基因rs2839698多態(tài)性與結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 等位基因A與結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)（P＜0.05），野生型基因AA、變異型基因AA+GA攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低（均P＜0.05）；調(diào)整性別、年齡后，結(jié)果顯示AA+GA攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。在不吸煙人群中，相對(duì)于GG，AA攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低（OR=0.49，95%CI：0.25～0.93，P＜0.05）；在不飲酒人群中，相對(duì)于 GG，GA攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低（OR=0.22，95%CI：0.10～0.51，P＜0.05）；在年齡≥60 歲人群中，相對(duì)于GG，AA攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低（OR=0.47，95%CI：0.27～0.81，P＜0.05）；在 BMI≥24 kg/m2人群中，相對(duì)于GG，AA攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低（OR=0.50，95%CI：0.30～0.84，P＜0.05）。

表1 H19基因rs2839698多態(tài)性與結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系[例（%）]

2.2 H19基因rs2839698多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 相對(duì)于GG，攜帶GA、AA、GA+AA的結(jié)直腸癌患者均不易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤直徑均更小（≤4 cm），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；但組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、家族史、組織學(xué)分型、腫瘤位置等臨床病理特征與H19基因rs2839698多態(tài)性未見(jiàn)關(guān)聯(lián)（均P＞0.05），見(jiàn)表 2。

表2 H19基因rs2839698多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系（例）

3 討論

lncRNA是人類轉(zhuǎn)錄本的主要成分[16]，通過(guò)干擾某些癌癥類型的基因表達(dá)來(lái)參與生物學(xué)過(guò)程[17-18]。最近研究表明，lncRNA在癌癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用[19-23]。另有研究表明，一些lncRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等[20]。Verhaegh 等[24]發(fā)現(xiàn)，rs2839698 多態(tài)性（攜帶TC）能降低膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，特別是非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌。但另一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)人群（1 049例膀胱癌患者與1 399例對(duì)照者）的研究表明，rs2839698多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)[13]。Gong等[11]研究發(fā)現(xiàn)H19基因rs2839698多態(tài)性與肺癌易感性之間未見(jiàn)關(guān)聯(lián)，但與肺癌的鉑類化療反應(yīng)有關(guān)。Yang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)漢族人群H19基因rs2839698多態(tài)性會(huì)增加胃癌患病風(fēng)險(xiǎn)，其中CT、TT與H19 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高有關(guān)。Li等[12]觀察到rs2839698多態(tài)性（攜帶A）者結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)增加，該單核苷酸多態(tài)性可能改變了關(guān)鍵的折疊結(jié)構(gòu)和H19基因的靶向微小RNA。

本研究結(jié)果顯示，A、AA、AA+GA與結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)；調(diào)整性別、年齡后，AA+GA與結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分層分析顯示，在不吸煙、年齡≥60歲、BMI≥24 kg/m2人群中，相對(duì)于GG，AA攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)均明顯降低；在不飲酒人群中，相對(duì)于GG，GA攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低。這與Li等[12]的研究結(jié)果不一致。分析原因，可能有以下4個(gè)方面：（1）本研究數(shù)據(jù)顯示H19基因rs2839698多態(tài)性與某些暴露因素存在明顯的交叉作用；（2）不同地區(qū)人群的飲食習(xí)慣和生活環(huán)境不同；（3）不同研究的基因分型方法及納入標(biāo)準(zhǔn)不同；（4）不同研究的結(jié)直腸癌惡性程度及病理類型不同。此外，本研究發(fā)現(xiàn)H19基因rs2839698多態(tài)性與結(jié)直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑明顯相關(guān)。

綜上所述，H19基因rs2839698多態(tài)性與結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑等臨床病理特征有關(guān)。攜帶AA、GA者患病風(fēng)險(xiǎn)降低，特別是不吸煙、不飲酒、年齡≥60 歲、BMI≥24 kg/m2者。