李志清 王殿奎 許 巖 李 婷 范桂強(qiáng) 孫金旭

（1 衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 河北 衡水 053000；2 衡水學(xué)院 河北 衡水 053000）

丹參(Salvia miltiorrhiza)，臨床上主要用于活血化瘀，治療心血管疾病、糖尿病等，藥用價(jià)值極高。丹參內(nèi)的主要化學(xué)成分為丹參黃酮、丹參素等物質(zhì)，和其他中藥配伍后，具有緩解失眠、肝損傷、體疲勞等癥狀的功效[1]。

在微生物發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生多種酶類，如木質(zhì)素酶、蛋白酶、纖維素酶等，這些酶類能夠非常有效的分解植物的細(xì)胞壁，擴(kuò)大細(xì)胞的間隙，有利于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，李嘉懿[2]、魏萌[3]分別用乳桿菌和芽孢桿菌發(fā)酵中草藥，通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，可使多糖含量比發(fā)酵前分別提高2.51 倍和1.57 倍，極大的提高了多糖的得率。

丹參中的活性物質(zhì)提取方法很多，而發(fā)酵法提取丹參黃酮的報(bào)道較少，本研究對(duì)發(fā)酵法提取丹參黃酮的過程進(jìn)行了探討，以期提高丹參活性物質(zhì)的提取量。

1 材料與方法

1.1 材料。丹參(購于衡水市醫(yī)藥公司，高純水清洗干凈后，于60 ℃烘干、粉碎，過60 目篩備用)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司提供)。

1.2 儀器與設(shè)備。高速萬能粉碎機(jī)(江陰市新雄機(jī)械制造有限公司生產(chǎn))；分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司生產(chǎn))；分光光度計(jì)UV-250(日本島津)；發(fā)酵桶(特百惠)。

1.3 黃酮含量測(cè)定方法[4]

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，放于100 ml 燒杯中，60%乙醇溶解后用100 ml 容量瓶做定容處理，得到100 mg/L 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。用移液槍分別吸取0 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)入比色管中，依次添加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，靜置6 min；添加10%硝酸鋁1 ml，搖勻，靜置6 min；加入4%的氫氧化鈉溶液10 ml；用60%的乙醇稀釋至刻度線，搖勻后，放入玻璃比色皿中。在510 nm 處測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=0.0135C-0.051，R2=0.9995。

1.3.3 丹參總黃酮的提取及測(cè)定。經(jīng)提取后的丹參黃酮提取液20 ml，用乙醇溶液(60%)稀釋定容至50 ml，按標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定方法測(cè)定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵菌種對(duì)丹參黃酮提取的影響。不同菌種在發(fā)酵過程中的代謝機(jī)制不同，所以產(chǎn)生的酶系和產(chǎn)物不同，對(duì)丹參發(fā)酵黃酮提取的影響不同。分別選取釀酒酵母、木醋桿菌、保加利亞乳桿菌、黑曲霉作為發(fā)酵菌種，以普通熱水提取為對(duì)照，試驗(yàn)不同菌種對(duì)發(fā)酵提取丹參黃酮的影響效果，結(jié)果如圖1所示。由圖1 可知，和對(duì)照相比，不同菌種對(duì)發(fā)酵提取丹參黃酮均有不同程度的提高。釀酒酵母菌對(duì)發(fā)酵提取丹參黃酮影響較大，與對(duì)照相比，丹參黃酮提取量提高42.07%，其它菌提高較少，最終確定以釀酒酵母菌作為提取丹參黃酮的發(fā)酵菌。

圖1 發(fā)酵菌種對(duì)丹參黃酮提取的影響

2.2 料液比例對(duì)發(fā)酵丹參黃酮提取量的影響。丹參經(jīng)粉碎后，分別按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 的料液比進(jìn)行配制，然后分別煮制，滅菌后，接種量0.8%，發(fā)酵1∶25 時(shí)，丹參黃酮提取量達(dá)到最大，之后隨料液比例的增大，丹參黃酮提取量有降低趨勢(shì)，表明，料液比例為1∶25 時(shí)較為適宜。

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵提取丹參黃酮的影響。經(jīng)粉碎后的丹參，按料液比1∶25 配比后，經(jīng)煮制、滅菌后，分別按照0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%的接種比例進(jìn)行接種，發(fā)酵16 h 后測(cè)定丹參黃酮提取量，結(jié)果如圖3所示。由圖3 可知，接種量對(duì)發(fā)酵丹參黃酮提取量有一定的影響，隨著接種量的增大，丹參黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)接種量達(dá)到1.1%時(shí)，丹參黃酮提取量達(dá)到最大，為33.19 mg/g，之后隨接種量增大，丹參黃酮提取量變化不大，因此，接種量設(shè)定為1.1%較為適宜。

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵丹參黃酮提取的影響

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵法提取丹參黃酮的影響。丹參經(jīng)粉碎后，配置料液比例1∶25，煮制滅菌后，按接種量1.1%接種酵母菌，每4 h 取樣測(cè)定，研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)丹參黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨發(fā)酵時(shí)間的延長，丹參黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到28 h 時(shí)，丹參黃酮提取量達(dá)到最大，為33.92 mg/g，因此，發(fā)酵提取丹參黃酮，發(fā)酵時(shí)間28 h 較為適宜。16 h 后，測(cè)定丹參黃酮提取量，結(jié)果如圖2所示。由圖2 可知，一定的料液比例對(duì)丹參黃酮提取量有一定的影響，隨著料液比例的提高，丹參黃酮提取量逐漸提高，當(dāng)料液比例達(dá)到

圖2 料液比例對(duì)發(fā)酵丹參黃酮提取的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵丹參黃酮提取的影響

3 結(jié)論與討論

發(fā)酵法提取丹參黃酮研究中，通過對(duì)發(fā)酵菌種的選擇，料液比例的確定，菌種接種量、發(fā)酵時(shí)間的確定，最終確定發(fā)酵提取丹參黃酮研究中的工藝參數(shù)如下：發(fā)酵菌種選擇酵母菌，料液比例確定為1∶25，接種量為1.1%，發(fā)酵時(shí)間28 h，此條件下丹參黃酮提取量達(dá)到33.92 mg/g，和普通熱浸提相比(21.25 mg/g)，丹參黃酮提取量相對(duì)提高59.62%，表明發(fā)酵法提取丹參黃酮相對(duì)于普通熱浸提是非常行之有效的。利用微生物對(duì)中藥成分進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，能夠有效的提高丹參中的活性成分，并在微生物酶的作用下，轉(zhuǎn)化產(chǎn)生新的活性成分，并可減輕毒副作用[4]。具體轉(zhuǎn)化機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。