顧秋平，朱方擎，劉金金，謝俊鋒，湯建華

贛州市人民醫(yī)院，江西 贛州 341000

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病的一種類(lèi)型［1］，發(fā)病人數(shù)逐年增多，其發(fā)病表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，病情反復(fù)，不易醫(yī)治。截至目前，UC 的成因以及發(fā)病機(jī)制還在研究當(dāng)中，有研究顯示，它的發(fā)生可能和遺傳以及腸道黏膜免疫反應(yīng)有一定的關(guān)聯(lián)［2］。白藜蘆醇存在于自然界很多植物中，屬于酚類(lèi)化合物，具有抑制炎癥、抗腫瘤等功效，與此同時(shí)，還能保護(hù)機(jī)體的重要臟器［3-4］。本研究通過(guò)建立UC 模型小鼠，研究調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）/輔助性T 細(xì)胞17（Th17）在白藜蘆醇治療UC 中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠50 只，8 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于贛州市人民醫(yī)院屏障級(jí)動(dòng)物房，12 h 光照和黑暗循環(huán)，室內(nèi)溫度22±2℃，濕度45%～55%。

1.2 主要試劑與儀器

白藜蘆醇（含量≥98%，上海源葉公司）；PBS 緩沖液（上海索萊寶公司）；莫能霉素（武漢欣欣佳麗公司）；白細(xì)胞介素17（IL-17）ELISA試劑盒（北京中檢公司）；白細(xì)胞介素23（IL-23）ELISA 試劑盒（北京中檢公司）；FBS（上?；鄯f公司）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：Callibur Ⅱ，美國(guó)Becton Dickinson 公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只。陰性對(duì)照組飲用純化水，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組與白藜蘆醇（Res）組飲用5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）7 d建立UC 模型。造模完成后，陰性對(duì)照組與模型對(duì)照組每日灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）0.2 mL；Res 低劑量組每日灌胃0.5%CMC-Na 溶解的8 mg/mL 的Res 0.2 mL；Res 高劑量組每日灌胃0.5%CMC-Na 溶解的16 mg/mL 的Res 0.2 mL；陽(yáng)性對(duì)照組每日灌胃0.5%CMC-Na 溶解的16 mg/mL 的柳氮磺吡啶栓（SASP）0.2 mL，5 組均連續(xù)給藥14 d。采用眼眶采血法采集小鼠外周血，離心分離得血清進(jìn)行ELISA 檢測(cè)；頸椎脫臼法處死小鼠，分離腸道黏膜組織，提取淋巴細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，按照ELISA 試劑盒檢測(cè)腸道黏膜組織IL-17 和IL-23 水平。

淋巴細(xì)胞提取方法：將腸黏膜組織放入細(xì)胞篩網(wǎng)內(nèi)，加入PBS 后研磨組織，收集單細(xì)胞懸液，500 g、4 ℃離心5 min，重懸單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。隨后加入莫能霉素，250 g 離心10 min，棄上清液，用含5% 胎牛血清（FBS）的PBS重懸，洗滌細(xì)胞兩次，收集細(xì)胞。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）比較各組小鼠Treg 和Th17 在T 淋巴細(xì)胞的占比以及Treg/Th17 比值。（2）各組腸道黏膜組織IL-17 和IL-23 的表達(dá)。（3）比較各組小鼠外周血IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腸道黏膜T 細(xì)胞亞群水平

各組Treg、Th17 以及Treg/Th17 均有差異（F=128.160、117.756、79.115，P<0.001）。與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠Treg 細(xì)胞占比、Treg/Th17 下調(diào)，Th17 細(xì)胞占比上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型對(duì)照組比較，Res 低劑量組、Res 高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組Treg 細(xì)胞占比、Treg/Th17 上調(diào)，Th17 細(xì)胞占比下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與Res 低劑量相比，Res 高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組Treg 細(xì)胞占比、Treg/Th17 上調(diào)，Th17 細(xì)胞占比下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腸道黏膜T細(xì)胞亞群水平比較（）

表1 各組小鼠腸道黏膜T細(xì)胞亞群水平比較（）

注：與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05，與模型對(duì)照組比較，bP<0.05，與Res低劑量組比較，cP<0.05。

2.2 黏膜組織IL-17 以及IL-23 的表達(dá)

各組腸道黏膜IL-17、IL-23 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=158.901、128.330，P<0.001）。與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-17、IL-23 上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型對(duì)照組比較，Res 低劑量組、Res 高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組IL-17、IL-23 下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與Res 低劑量相比，Res 高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組IL-17、IL-23 下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠IL-17以及IL-23的表達(dá)（pg/mg，）

表2 各組小鼠IL-17以及IL-23的表達(dá)（pg/mg，）

注：與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05，與模型對(duì)照組比較，bP<0.05，與Res低劑量組比較，cP<0.05。

2.3 小鼠外周血炎癥因子的表達(dá)

各組外周血IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)均存在 差 異（F=224.912、84.953、77.228，P<0.001）。與陰性對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1β、IL-6 和TNF-α 上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型對(duì)照組比較，Res 低劑量組、Res 高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組IL-1β、IL-6 和TNF-α 下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與Res 低劑量相比，Res高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組IL-1β、IL-6 和TNF-α下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠外周血炎癥因子的表達(dá)（nmol/L，）

表3 各組小鼠外周血炎癥因子的表達(dá)（nmol/L，）

注：與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05，與模型對(duì)照組比較，bP<0.05，與Res低劑量組比較，cP<0.05。

3 討論

相關(guān)研究顯示，Th17、Treg 細(xì)胞參與了UC 的發(fā)病，與之有著不容忽視的關(guān)聯(lián)［5-6］。Th17 細(xì)胞能夠生成IL-17，并將之分泌到細(xì)胞外，參與到炎癥反應(yīng)。在炎性腸病的發(fā)展當(dāng)中，IL-17 能夠聯(lián)合IL-23 加重炎癥反應(yīng)。Treg 細(xì)胞的功能便是負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，另外，它還參與了外周免疫耐受的產(chǎn)生、免疫平衡的穩(wěn)定，對(duì)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)意義重大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，模型對(duì)照組小鼠腸黏膜組織中的Treg 細(xì)胞占比在下調(diào)，Th17 細(xì)胞則在上調(diào)，且Treg/Th17 也在下調(diào)，說(shuō)明模型對(duì)照組小鼠體內(nèi)存在Treg 和Th17 比例失衡。進(jìn)一步檢測(cè)IL-17 以及IL-23 水平，發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組IL-17 和IL-23 水平的確存在上調(diào)，進(jìn)一步印證了Treg 和Th17 比例的失衡。

各種細(xì)胞因子在UC 的發(fā)生與發(fā)展中也會(huì)起到一定的作用［7］，這些細(xì)胞因子主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，有連結(jié)各免疫細(xì)胞功能的作用，使得免疫功能更加迅速與穩(wěn)定；另外，細(xì)胞還能通過(guò)分泌到細(xì)胞外，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)。促炎性細(xì)胞因子［8］（IL-1、IL-6 和TNF-α 等）被認(rèn)為與UC 的發(fā)生關(guān)聯(lián)重大。在UC 發(fā)生時(shí)，這些促炎因子能導(dǎo)致中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量大量增長(zhǎng)，進(jìn)一步分泌更多促炎因子來(lái)加重自身炎癥反應(yīng)，UC 的發(fā)作也變得嚴(yán)重又漫長(zhǎng)，對(duì)腸黏膜組織造成嚴(yán)重傷害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，模型對(duì)照組小鼠促炎性細(xì)胞因子釋放增加，說(shuō)明UC 小鼠機(jī)體炎癥作用很劇烈，UC 會(huì)導(dǎo)致促炎因子大量釋放。

白藜蘆醇屬于多酚類(lèi)物質(zhì)，其主要在抗氧化，抗炎以及抗腫瘤等方面發(fā)揮作用［9］。目前很多研究中，白藜蘆醇也參與到了UC 預(yù)防和治療當(dāng)中［10］。也有臨床研究顯示，口服白藜蘆醇能夠顯著降低UC 患者腸道炎癥反應(yīng)，改善患者的臨床病癥。在UC 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇能降低UC 小鼠的氧化應(yīng)激并且能下調(diào)促炎因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在使用了白藜蘆醇干預(yù)后，Treg 細(xì)胞百分比上升，Th17細(xì)胞百分比下降，Treg/Th17 比值上升，在向正常小鼠接近，IL-17 以及IL-23 的表達(dá)也在降低。檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6 和TNF-α 均下降，且高劑量的白藜蘆醇對(duì)上述指標(biāo)的改善作用更加明顯。說(shuō)明白藜蘆醇能通過(guò)調(diào)控Treg/Th17 免疫平衡來(lái)降低炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，并且高劑量作用效果更佳。