王曉艷

（山東省臨沂市莒南縣檢驗檢測中心 山東臨沂 276600）

1 概述

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉等霉菌在一定的溫度和濕度下產生的結構相似的代謝產物，黃曲霉菌廣泛存在于自然環(huán)境中，高溫、高濕是黃曲霉菌生長與繁殖的良好條件。

2 危害

黃曲霉毒素B1 是所有已知黃曲霉毒素中毒性最強的一種。據文獻介紹，其毒效相當于氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍，是迄今為止發(fā)現的致癌性最強的天然毒物，而且對大多數動物都有強烈的毒性作用，其危害主要表現在以下幾個方面：

2.1 飼料適口性差

污染的飼料在霉變過程中，霉菌的生長消耗了飼料中的營養(yǎng)物質，并分解飼料中的蛋白質和糖化淀粉，使飼料顏色、氣味、品質發(fā)生改變，從而影響了飼料的適口性，畜禽表現餓而不食，趨食槽而不親料，有鉤料、刨料、剩料現象，導致采食量降低，生長發(fā)育受阻。

2.2 動物繁殖性能降低

黃曲霉毒素能夠破壞雄性畜禽睪丸功能，導致睪丸萎縮，曲精細管發(fā)育不良，妨礙精液產生，精液質量下降，受精率低，性欲降低或喪失。

母畜：出現流產、死胎、木乃伊胎、畸形胎以及產后不發(fā)情、假發(fā)情、遲發(fā)情等繁殖障礙,無乳、少乳、乳腺炎現象增多。

育肥豬、保育豬：表現體溫升高，皮膚發(fā)紅，食欲下降、外陰紅腫，出現早發(fā)情、假發(fā)情現象。

母禽：表現卵巢發(fā)育不良或不發(fā)育，產蛋率下降，蛋品品質差。

2.3 引起機體免疫抑制

能夠抑制核酸蛋白質的生物合成，阻礙生物轉化、破壞吞噬細胞，損害免疫系統(tǒng)，抑制免疫應答，造成免疫失敗，為其它疾病的繼發(fā)感染埋下了隱患，所以霉菌毒素中毒被業(yè)內專家形象地稱為“底色病”。

2.4 造成肝毒、腎毒、肺毒、腸毒癥

黃曲霉毒素能夠損傷肝臟，引起肝臟腫大硬化，降低肝臟的解毒消化機能；損傷腎臟，破壞腎臟的排毒排泄機能，造成機體代謝障礙；侵害肺臟，特別是年幼畜禽對黃曲霉菌毒素更加敏感，尤其是養(yǎng)殖環(huán)境中霉菌毒素超標，吸入后極易引發(fā)肺臟生成腫瘤、結節(jié)、霉斑，導致肺功能降低或喪失；引發(fā)腸炎，家禽表現排料糞、稀糞、魚腸子糞、西紅柿樣糞，家畜表現消化不良，糞便稀薄，糞便黏稠，重者血便等癥狀。

3 檢測

日常工作中，通常采用免疫親和柱凈化結合高效液相色譜法來檢測飼料中黃曲霉毒素B1，該方法簡便快速，靈敏準確，特異性高，實用性強。

這種分野在杜特爾特政權內部也現實存在。2017年3月，在中國海洋科考船過航“賓漢隆起”一事上，菲律賓防長表達了與總統(tǒng)杜特爾特不同的觀點；[41]4月菲律賓代外長馬納洛也在采訪中表達了與杜特爾特“疏美”立場相異的觀點。[42]上述分歧既可能是菲國內親美勢力的反彈與施壓，也可能源自于杜特爾特政權迫于國內政治壓力的讓步。

3.1 試驗原理

樣品經過甲醇水提取后，提取液經過濾、稀釋后，使用免疫親和柱層析凈化，最后經高效液相色譜分離柱后光化學衍生熒光檢測器檢測，外標法定量。

3.2 所需試劑

甲醇（色譜純），默克公司；乙腈（色譜純），默克公司；氯化鈉（分析純）；黃曲霉毒素B1 標準品，Sigma 公司，黃曲霉毒素B1 原液濃度為20μg/mL，使用前逐步稀釋成100ng/mL 濃度的工作液。

3.3 主要儀器設備

Agilent 1260 高效液相色譜儀帶FLD 熒光檢測器、光化學衍生器、高速混勻器、玻璃纖維濾紙、固相萃取裝置帶真空泵等。

3.4 樣品制備

按照GB/T 14699.1—2005 采集樣品，按照GB/T 20195—2006 用四分法縮減至500g，用粉碎機粉碎后過1mm 孔徑的分析篩，混勻后作為待檢樣品。

3.5 黃曲霉毒素B1 毒素的提取與純化

稱取25g 待檢樣品加入5g 氯化鈉與125mL 的甲醇水（70:30）溶液混勻，高速混勻20min，使用快速定性濾紙過濾收集濾液，取10mL 濾液加入20mL 的超純水稀釋，再用玻璃纖維濾紙過濾，收集濾液作為上樣液備用。

取15mL 上樣液過免疫親和柱凈化，調節(jié)固相萃取裝置壓力，使液體以1～2 滴/s 的速度流出。待柱內液體排干后，用10mL 超純水洗滌柱子兩次，流速為2～3 滴/s。待液體完全排干后，增大壓力使免疫親和柱完全抽干。上樣1mL 的甲醇洗脫，為了能夠更好的地洗脫毒素，加入甲醇之后最好孵育1min。流速為1 滴/s，收集洗脫液并定容至1mL。洗脫液使用0.22μm 的有機微孔過濾器過濾并轉移至樣品瓶中，供色譜分析用。

3.6 色譜條件

流動相：超純水60+乙腈:甲醇（1:1）40 等度洗脫；

色譜柱：Agilent C18 柱（規(guī)格：150mm*4.6mm，填料粒徑5μm）；

流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；進樣量：50μL；波長：激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長440nm。

3.7 高效液相色譜（HPLC）測定

3.7.1 標準工作曲線對0.10、0.50、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0ng/mL 的系列標準溶液按以上色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得到標準曲線回歸方程（圖1）。

圖1 標準曲線線性圖譜

3.7.2 測定圖譜 標準樣品（圖2）、待檢樣品（圖3）、加標樣品（圖4）色譜測定圖譜如下。

圖2 標準樣品圖譜

圖3 待檢樣品圖譜

圖4 加標樣品圖譜

3.8 精密度與回收率試驗

1）飼料樣品中黃曲霉毒素B1 精密度試驗（以2 份飼料為例）：按照上述試驗方法處理2 份不同飼料樣品，分別做5 個平行，然后分別上機進行色譜測定，其結果的標準偏差（RSD，%）分別為4.551%，2.918%。具體結果見表1。

表1 黃曲霉毒素B1測定的精密度

2）飼料樣品中黃曲霉毒素B1 回收率試驗：在2 份已知的空白飼料樣品中，分別加入20ng/mL 濃度的黃曲霉毒素B1 標準溶液，同樣按照上述試驗方法處理加標樣品，分別做5 個平行，然后分別上機測定，其結果的標準偏差（RSD，%）分別為4.373%、4.273%。測定平均回收率為95.268%、94.646%，具體結果見表2。

表2 黃曲霉毒素B1測定的回收率

3.9 線性范圍與最小檢測量

黃曲霉毒素B1 濃度在0.1～40ng/mL 范圍內呈良好線性關系，相關系數為0.99999，該方法的檢出限為0.1μ g/kg，殘留標準誤差為0.83937。

4 小結

“病從口入”。品質優(yōu)良的飼料是畜牧業(yè)健康發(fā)展的基礎，飼料質量的優(yōu)劣不僅關系到動物安全和生產效益，而且直接影響人們的身體健康及公共環(huán)境安全。因此，在畜禽養(yǎng)殖生產過程中，廣大從業(yè)人員一定要加強行業(yè)自律，嚴把飼料原料關，強化飼料生產、運輸、儲存等環(huán)節(jié)的監(jiān)管、檢測，防止飼料及原料污染、霉變，為社會輸出優(yōu)質、安全、綠色、無污染的畜禽及其產品，讓人們吃的安心，用的放心。