蘇章庭 曾曉琮 劉秋婷 劉單單 鐘衛(wèi)燁 段星星 周露

（廣東省食品檢驗所 廣東廣州 510435）

1 前言

沙門菌氏廣泛分布于自然界，寄生于人和動物體內(nèi)，亦常見于污染的蛋、奶及其制品、肉類、食品、飼料、水產(chǎn)品和污水等外環(huán)境。沙門氏菌是最常見的食源性致病微生物之一。據(jù)統(tǒng)計，在世界各類細(xì)菌性食物中毒事件中，沙門氏菌引起的食物中毒事件常列榜首。沙門氏菌感染不僅在發(fā)展中國家有較高發(fā)病率，在發(fā)達(dá)國家也存在同樣的情況，并且在低收入國家造成更高的死亡率。目前，一旦感染沙門氏菌，會給發(fā)展中國家和工業(yè)化國家?guī)砹顺林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。中國內(nèi)陸地區(qū)的食物中毒事件也以沙門氏菌為首位。沙門氏菌可以引起人類傷寒、副傷寒和胃腸炎、敗血癥和局部感染等許多疾病。

沙門氏菌本身并不能自行傳播，需要特定媒介才能傳播到其他環(huán)境。如食品、鳥類遷徙、污水等都會造成污染物的轉(zhuǎn)移。這些污染物主要來自糞便，所以還包含了許多除了沙門氏菌外的其他病原體。因此，沙門氏菌的流行病學(xué)和糞便污染的流行病學(xué)密切相關(guān)，并可以由此得出其他病原體的傳播途徑，包括一些人畜共患病的微生物，如小腸耶爾森菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、肉毒梭菌，甚至還有一些寄生蟲和病毒等[1]。由于全球化的發(fā)展，世界各地區(qū)之間的人流物流日益廣泛和頻繁，病原體也隨之迅速擴(kuò)散，并且不像以前要由鄰接地區(qū)由近而遠(yuǎn)地擴(kuò)散，而是直接跨越地區(qū)造成國家之間乃至洲之間的迅速擴(kuò)散，很難從流行的表面發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在聯(lián)系[2]。研究由沙門菌引起的食源性疾病，為了尋找其傳播來源與傳播鏈，不僅需要現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查，還需要對病原體進(jìn)行詳盡地檢測與分析，對病原細(xì)菌進(jìn)行科學(xué)的分類和分型，一方面有利于揭示食源性疾病的本質(zhì)，另一方面可以對爆發(fā)源頭進(jìn)行溯源。因此，建立一套科學(xué)的分類方案和快速、敏感的分型技術(shù)對于傳染源的追蹤、溯源、爆發(fā)疫情的鑒定以及最終有效地控制疫情意義重大[3]。

2 沙門氏菌的定義

2.1 腸桿菌科

腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細(xì)菌是常見的人類微生物之一，是影響腸道微生態(tài)的重要菌科，其中包括很多可導(dǎo)致食品腐敗的細(xì)菌和某些腸道病原菌。腸桿菌科屬于細(xì)菌界、變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目腸桿菌科。1937年Rahn提出建立腸桿菌科以來，所含屬的范圍經(jīng)歷了多次變動，現(xiàn)有的分類方法將其劃分為44屬與8個未分類的群。其主要表型特征可見表1[4]。

表1 腸桿菌科的主要表型特征

對腸桿菌科細(xì)菌的定義，只能代表大多數(shù)菌屬及菌種的表型特征。隨著對腸桿菌科細(xì)菌的進(jìn)一步認(rèn)識以及科內(nèi)菌屬及菌種的不斷增多，使學(xué)術(shù)界對腸桿菌科細(xì)菌的定義不斷發(fā)生變化?？傮w上講，長期以來對腸桿菌科細(xì)菌的定義，主要是依據(jù)其形態(tài)特征、鞭毛生長及動力、有無莢膜及芽孢、代謝類型、氧化酶及過氧化氫酶的產(chǎn)生、生長條件、生境及致病作用等方面予以概述。

2.2 沙門氏菌屬

沙門氏菌是腸桿菌科的重要成員，對于沙門氏菌的定義一直以來都在不斷完善。在Edwards和Ewing所著《腸桿菌科的鑒定》當(dāng)中，沙門氏菌屬的定義是：“沙門氏菌屬為符合腸桿菌科和沙門氏菌族定義的有動力的細(xì)菌所組成。不產(chǎn)生尿素酶，不利用丙二酸鈉，不液化明膠，在含氰化鉀培基中不生長。對賴氨酸、精氨酸和烏氨酸有脫羧作用。在Jordan氏酒石酸鉀鈉培養(yǎng)基中產(chǎn)酸。能發(fā)酵衛(wèi)矛醇，多數(shù)菌株能利用肌醇，不發(fā)酵蔗糖，水楊苷，棉子糖和乳糖。代表種為豬霍亂沙門氏菌?！?/p>

族（Tribes）是介于科與屬之間的分類級別。沙門氏菌族是符合腸桿菌科定義的有動力的細(xì)菌。主要的生化現(xiàn)象包括甲基紅反應(yīng)陽性、VP試驗陰性、不形成靛基質(zhì)、苯丙氨酸不脫氨、在營養(yǎng)培基中不能迅速液化明膠。除少數(shù)例外，能產(chǎn)生大量的硫化氫，在Simmons氏枸櫞酸鹽和醋酸鈉培養(yǎng)基上能生長，能形成精氨酸雙水解酶，在能發(fā)酵的碳水化合物中產(chǎn)氣，不能水解七葉苷，不發(fā)酵赤蘚醇和側(cè)金盞花醇[5]。

《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology）第七版和第八版中所列的族和各族所包括的屬有很顯著的變動。在第七版中，埃希氏族包括埃希氏屬、腸桿菌屬（Enterobactor）和克雷伯氏菌屬 （Klebsiella），而沙門氏菌屬（Salmonella）和志賀氏菌屬（Shigella）則包括在沙門氏菌族中。在第八版中，沙門氏菌族被刪去?？死撞暇鷮俜旁诳死撞暇逯?，沙門氏菌屬和志賀氏菌屬都轉(zhuǎn)到埃希氏菌族中[6-7]。

《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌手冊》（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）第二版對于沙門氏菌屬，族的概念已經(jīng)不再應(yīng)用。沙門氏菌屬的定義為“沙門氏菌屬應(yīng)該符合腸桿菌科的一般定義。形態(tài)直桿，0.7-1.5×2.0-5.0μm，革蘭氏陰性。通常以周生鞭毛運動。兼性厭氧。有機(jī)化能異養(yǎng)，具有呼吸和發(fā)酵兩種代謝類型。最適宜生長溫度為37℃。菌落的直徑通常為2～4 mm。DNA的G+C%的摩爾分?jǐn)?shù)是50～53。模式種為豬霍亂沙門氏菌，生化反應(yīng)通常為D-葡萄糖產(chǎn)氣，TSI產(chǎn)硫化氫，吲哚和VP反應(yīng)陰性?？衫脵幟仕猁}作為碳源。賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)通常為陽性，苯丙氨酸和色氨酸脫羧酶、脂肪酶、DNA酶陰性，不能水解尿素。通常不發(fā)酵蔗糖、水楊素、肌醇和苦杏仁苷，對人類有致病性，可引起腸熱、胃腸炎和敗血病，也可以感染多種動物物種，是一些血清病毒嚴(yán)格的宿主[8]。”

3 沙門氏菌分類與命名

3.1 沙門氏菌的分類

3.1.1分類方案

沙門氏菌屬的分類有過多種方案，其不同的分類指標(biāo)涵蓋了表型方法，血清學(xué)特征，數(shù)值分類學(xué)和DNA同源性等。在早期的分類方案發(fā)展過程中，主要是通過生化反應(yīng)將沙門氏菌分成亞群（subgroup）。Kauffmann-White方案使用生化反應(yīng)對沙門氏菌進(jìn)行系統(tǒng)分類。最終確定了5種由生化反應(yīng)定義的亞屬（I至V）。在這個分類方案中，每一種血清型被定義為一個種。其中，亞利桑那菌屬被列入亞屬III中。隨后，Ewing提出了一個3種命名系統(tǒng)，使用16種生化試驗來鑒別傷寒沙門氏菌（S.typhi，單一血清型）、豬霍亂沙門氏菌（S.choleraesuis，單一血清型）和腸炎沙門氏菌（S.enteritidis，所有其他沙門氏菌血清型）。該種方案認(rèn)為亞利桑那菌屬為一個獨立的屬。1973年Crosa等根據(jù)DNA-DNA雜合試驗研究，認(rèn)為沙門氏菌屬4個亞屬和亞利桑那的代表株高度相關(guān)。在遺傳和進(jìn)化觀點上，認(rèn)為所有的菌株屬于同一個菌種。在生化反應(yīng)、抗原結(jié)構(gòu)、對宿主適應(yīng)力和地理分布上的差異，是一個單一菌種內(nèi)的離散，提議并入沙門氏菌屬，這在沙門氏菌分類學(xué)上確立了一個發(fā)展方向。隨后Le Minor等基于數(shù)值分類學(xué)和DNA親緣關(guān)系提出了一個由7個亞種組成的單一種豬霍亂沙門氏菌（S.choleraesuis）。后來該方案進(jìn)一步進(jìn)行了修改（Le Minor和Popoff，1987），將豬霍亂沙門氏菌改名為腸炎沙門氏菌，對于其他7個亞種的名稱予以保留。

通過使用多位點酶電泳技術(shù)（multilocus enzyme electrophoresis，MLEE），邦戈爾沙門氏菌（S.bongori）從豬霍亂沙門氏菌中分離了出來并作為新的種（Reeves等，1989）。如今以下的命名法現(xiàn)已被國際學(xué)界正式接受（Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Prokaryotes，2005）：沙門氏菌屬由2個種組成，分別是腸炎沙門氏菌（enterica，包含6個亞種）和邦戈爾沙門氏菌（bongori）。每個種都有多個血清型。亞種是根據(jù)生化性狀和基因組親緣關(guān)系來區(qū)分的。該分類方案也被《伯杰氏系統(tǒng)分類學(xué)手冊》第二版所采用。沙門氏菌的各個時期的分類方案見表2[9-10]。

表2 沙門氏菌的不同分類方案

3.1.2分型方法

3.1.2.1表型分型

（1）血清學(xué)方法

今天使用的沙門氏菌的血清型分類主要是依據(jù)血清學(xué)方法中的凝集（agglomeration）反應(yīng)作為判斷依據(jù)。凝集反應(yīng)是指顆?？乖c相應(yīng)的抗體結(jié)合后，可出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，根據(jù)凝集與否，判定樣品是否存在待檢的抗原或抗體，可作定性檢測[11]。Kauffmann和White對抗體與細(xì)菌表面抗原相互作用研究后得出，沙門氏菌的3種表面抗原（O抗原、H抗原和Vi抗原）決定了對特異性抗血清的反應(yīng)。利用沙門氏菌特異血清與其菌體表面的抗原與血清的反應(yīng)，根據(jù)產(chǎn)生顆粒狀凝集現(xiàn)象來判斷對該種血清型凝集的陰陽性，通過查詢沙門氏菌的Kauffmam-White血清表可以確認(rèn)菌株的血清型。一般的沙門氏菌的鑒定血清試劑盒中含有O抗原和H抗原的多價血清和單價的血清，使用多價血清可以縮小菌株鑒定的范圍，而后再使用單價血清進(jìn)一步鑒定出菌株的血清型。某些的血清型可能是抗原變異的結(jié)果[12-15]。沙門氏菌血清型分布的歷年數(shù)量變化見表3。

表3 血清型分布的歷年數(shù)量變化[16-17]

（2）噬菌體方法

血清學(xué)對病原體的檢測與鑒定主要是根據(jù)其表型特征進(jìn)行區(qū)分的。隨著研究的不斷深入，在分析傳染源、傳播途徑及闡明傳染病流行規(guī)律等方面，一般的血清學(xué)表型研究已經(jīng)不能滿足流行病學(xué)研究的需要。而噬菌體分型具有能夠區(qū)分沙門氏菌中相同血清型的分離株中的變種的能力。噬菌體是一種專性的細(xì)胞內(nèi)寄生物，分為烈性噬菌體和溫和噬菌體[18]。沙門氏菌表面具有噬菌體特異性受體，使得噬菌體的侵染具有高度特異性。通常一種噬菌體只能侵染沙門氏菌的某種血清型，甚至是同一血清型的特定菌株。因此，噬菌體分型可對血清型進(jìn)行更細(xì)化的分類[19-21]。目前噬菌體分型已經(jīng)應(yīng)用于沙門氏菌的多個血清型。國際采用的噬菌體分型方案包括傷寒沙門氏菌，副傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌[22]。傷寒噬菌體的型別比較穩(wěn)定。在一個患者或帶菌者體內(nèi)多次分離的菌株，或在同一傳染源引起的傷寒流行病例中，往往從各個病例中分離的菌株都是同一型別。一方面，沙門氏菌的噬菌體分型工作對追蹤傳染源和探索傳播途徑，在流行病學(xué)上有重要意義[23]。噬菌體分型的局限性在于可用于分型的噬菌體種類有限，使得許多菌株無法分型，從而限制了該技術(shù)區(qū)分菌株的能力。另一方面，噬菌體分型需要長期維持多種噬菌體儲備。此外，為了獲得準(zhǔn)確的和可重復(fù)的分型結(jié)果，通常由參考實驗室使用維護(hù)良好的噬菌體庫和經(jīng)過專門培訓(xùn)的專業(yè)人員進(jìn)行噬菌體分型[24]。

3.1.2.2分子分型

既往對病原體的鑒定，主要定義到種級以及進(jìn)一步的生物型別。這些鑒定依靠病原體的種屬分類學(xué)、主要結(jié)構(gòu)成分和數(shù)十個生化反應(yīng)指標(biāo)。然而具有相同表面標(biāo)志和一些生化代謝指征的同種微生物，而在其基因組序列上會表現(xiàn)出很大的差異。因此，對一株病原體的特征定義，已從主要特征的描述和分類向全基因組序列的差異進(jìn)行精細(xì)定義，從而更精準(zhǔn)地區(qū)分出同種（型）的不同菌毒株[25]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子分型技術(shù)也逐步應(yīng)用于沙門菌分型。

基于核酸序列沙門菌的分型方法中，常用的技術(shù)有脈沖場凝膠電泳（PFGE）、多位點序列分析（MLST）、多位點VNTR擴(kuò)增的基因分型方法（MLVA）等。其中，PFGE技術(shù)在沙門菌中已應(yīng)用成熟。PFGE技術(shù)不同于傳統(tǒng)的表型分型技術(shù)，而是從DNA水平對病原菌進(jìn)行鑒定分型，比較不同菌株產(chǎn)生的帶型是否一致，以判斷菌株間的相似性，為散發(fā)性傳染病和暴發(fā)性傳染病的溯源提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。PFGE分型的主要優(yōu)點是，該方法對于絕大多數(shù)菌株都具有高度可重復(fù)性，可以在多個實驗室之間共享數(shù)據(jù)。目前，國際上已經(jīng)以PEFG為基礎(chǔ)建立了PulseNet對食源性疾病的病原菌進(jìn)行監(jiān)測，已在多次食物中毒的溯源調(diào)查中發(fā)揮了良好作用[26]。

3.2 沙門氏菌的命名

對于沙門氏菌的命名，早期命名強(qiáng)調(diào)病理學(xué)特征和分離菌株來源的動物種類，如傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、羊流產(chǎn)沙門氏菌等現(xiàn)仍用于臨床細(xì)菌學(xué)，但是一種沙門氏菌引起的疾病并不限于一種動物，如牛沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌也可引起人類疾病。后又改為采用分離菌株來源的城鎮(zhèn)、地區(qū)或國家名稱命名，但此命名法不能體現(xiàn)進(jìn)化親緣關(guān)系。這一類的命名常常用于在人類或獸醫(yī)學(xué)中常見的沙門氏菌。在其他細(xì)菌種類中（如大腸桿菌），尚未對血清型進(jìn)行命名，其血清型直接由抗原式來進(jìn)行表示。但是，常見的沙門氏菌血清型名稱已經(jīng)在業(yè)界長期廣泛使用，以至于棄用這些名稱而使用其抗原公式進(jìn)行代替是不現(xiàn)實的。目前大部分的血清型集中在腸炎沙門氏菌的腸道亞種中，所以保留了腸道亞種血清型的名稱[27-29]。

美國疾病控制與預(yù)防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）使用如下的命名方法，見表4。

表4 美國CDC沙門氏菌命名法/書寫方式

4 《伯杰氏系統(tǒng)分類學(xué)手冊》分類方案

在1994年出版的《伯杰鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》第九版中，對沙門菌屬的細(xì)菌進(jìn)行了種（亞種、血清型）的劃分，將沙門氏菌屬分為了邦戈爾沙門菌、豬霍亂沙門茵2個種。在第2版《伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》（2005）采用了Reeves等在1989年提出的分類方案，將沙門氏菌屬分為了邦戈爾沙門菌、腸炎沙門茵兩個種。種與亞種之間的生化反應(yīng)區(qū)別見表5。

表5 《伯杰氏系統(tǒng)分類學(xué)手冊》分類方案

5 《GB 4789.4-2016食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》中沙門氏菌分類方案

《GB 4789.4-2016食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》使用了“生化群”的分類級別，將沙門氏菌依據(jù)生化反應(yīng)分為6個生化群（見表6）。整體分類與國際主流分類方案相似，只是簡化了部分生化反應(yīng)，且未對亞利桑那亞種與雙相亞利桑那亞種作出區(qū)分。但是在實際工作中，可以通過H相血清對亞利桑那亞種與雙相亞利桑那亞種加以鑒別區(qū)分。亞利桑那亞種與雙相亞利桑那亞種的主要生化區(qū)別是半乳糖醛酸、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和β-葡糖苷酸酶的反應(yīng)不同[30-31]。

表6 GB 4789.4-2016中沙門氏菌分類方案

6 《ISO 6579-1-2017食物鏈的微生物學(xué).采用水平方法的沙門氏菌檢測，計數(shù)和血清分型.檢測沙門氏菌屬》分類方案

從流行病學(xué)的角度，沙門氏菌可分為3類：

（1）僅感染人類的血清型：包括傷寒沙門氏菌（S.Typhi）和副傷寒沙門氏菌（S.Paratyphi）。該組細(xì)菌包括的細(xì)菌能夠引起傷寒和副傷寒，這是沙門氏菌所能夠引起的疾病中最嚴(yán)重的一種。傷寒熱的潛伏期較長，能夠引起高燒，以及具有較高的死亡率。

（2）特異宿主的血清型，主要對特定動物致?。喊u沙門氏菌（S.Gallinarum，家禽），都柏林沙門氏菌（S.Dublin，牛），馬流產(chǎn)沙門氏菌（S.Abortus-equi，馬），綿羊流產(chǎn)沙門氏菌（S.Abortus-ovis，綿羊）和豬霍亂沙門氏菌（S.Choleraesuis，豬），等等。

（3）無特異宿主的血清型：多數(shù)的沙門氏菌，都是這一類人及動物共染的病原菌；且動物宿主范圍非常廣泛。人可因食用患病動物的肉或被污染的食物而致病[32-33]。

臨床中也有通過結(jié)合臨床癥狀分為傷寒沙門氏菌（Typhoidal Salmonella）與非傷寒沙門氏菌（Non-Typhoidal Salmonella，NTS）。傷寒沙門氏菌包括腸炎沙門氏菌腸炎亞種中的傷寒血清型和甲、乙、丙型副傷寒血清型。傷寒沙門氏菌是引起傷寒和副傷寒的病原細(xì)菌，主要體現(xiàn)為引起以發(fā)熱為特征的全身性疾病。常見的并發(fā)癥是中毒性肝炎和中毒性心肌炎，嚴(yán)重的并發(fā)癥可有腸出血和腸穿孔等。非傷寒沙門氏菌主要誘發(fā)急性、自限性胃腸炎。少于10%的患者會發(fā)展成菌血癥。食源性感染是人類NTS最常見的感染方式[34-35]。

ISO 6579-1：2017中，通過TSI，尿素，賴氨酸，β-半乳糖苷，吲哚進(jìn)行一個初步的生化分類，以快速篩選出對危害較大的沙門氏菌血清型。其具體的分類方法見表7[36]。

表7 ISO 6579-1：2017對于部分沙門氏菌血清型的鑒定方法

7 結(jié)論

沙門氏菌的鑒定與分型可以對沙門菌感染疾病進(jìn)行溯源，從而給予正確的臨床針對性治療。面對沙門菌感染事件，在短時間內(nèi)對病原菌正確分類也有利于沙門菌感染病例進(jìn)行有效管理。對于沙門氏菌的分類方案與命名方法，在不同時期一直處于變化當(dāng)中。隨著人們對病原細(xì)菌研究的不斷深入，特別是分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，沙門氏菌的分類與分型技術(shù)也將持續(xù)發(fā)展。及時關(guān)注細(xì)菌分類學(xué)的變化，規(guī)范使細(xì)菌學(xué)名，可以使得我們的鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確、科學(xué)，從而進(jìn)一步接軌國際上的研究工作，更好地促進(jìn)學(xué)術(shù)間的交流。