賈晨 高峰 孫娟 趙春暉 呂芳 張園 王秀林 沈媛

（北京市水產(chǎn)技術推廣站/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京） 北京 100176）

1 前言

抗生素（Antibiotics）是一類由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬等）或高等動植物在代謝過程中產(chǎn)生的或由人工合成的化合物，它們是可以抑制或殺死其他微生物的一類次級代謝產(chǎn)物，能夠干擾其它生活細胞的發(fā)育功能[1]。氟喹諾酮類藥物作為其中一類抗生素，和其他抗菌藥物作用不同的一點在于，其以細菌的脫氧核糖核酸為靶點，通過抑制細菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶的合成從而對染色體造成不可逆損害，導致細胞不再進行分裂，快速抑制細菌的生長，產(chǎn)生殺菌作用[2]。由于其抗菌譜廣、抗菌活性強、與其他藥物無交叉耐藥性且價格低，因此被廣泛應用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[3]。

氟喹諾酮類藥物（FQs）是一類合成抗菌藥物，低劑量的氟喹諾酮類藥物在集約化禽畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖中大量使用，具有促進禽畜生長和抑制水產(chǎn)品真菌感染等作用[4]。在其廣泛應用的同時，也存在一些問題，一方面，過量使用會直接對人體造成危害，不良反應也有很多：會引起未成年動物關節(jié)組織中軟骨損失；引起消化系統(tǒng)不良反應；造成血液系統(tǒng)中血細胞及血小板減少；肝臟毒化反應等[5]。另一方面，氟喹諾酮類藥物通過不同途徑進入環(huán)境中，其溶解性較差，且性質(zhì)穩(wěn)定、半衰期較長、不易降解，只能在紫外燈條件下進行光解或生物降解[6]，會在水環(huán)境和沉積物中不斷進行累積，導致其在水環(huán)境和沉積物中的濃度不斷升高，很容易引發(fā)細菌耐藥性，甚至產(chǎn)生超級細菌，增加養(yǎng)殖患病風險，從而對人類身體健康產(chǎn)生潛在威脅。近年來，此類藥物的不當使用所引起的環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題也成為研究熱點。

目前，此類藥物的檢測方法主要有：酶聯(lián)免疫法[7]、高效液相色譜法[8-9]、膠體金免疫層析法[10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-13]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法由于其較好的分離度和較高的靈敏度逐漸成為同時檢測氟喹諾酮類藥物的主要手段。因此，本文借助超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）高選擇性、高靈敏度的優(yōu)勢，經(jīng)過優(yōu)化色譜條件、流動相種類和比例、EDTA緩沖液的pH值等措施，對復雜樣品進行檢測分析，能有效地節(jié)省檢測時間和試劑耗材，適用于大批量樣品的快速篩選和定量測定。

本文旨在建立一種測定水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘底泥中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，將其應用于實際漁場底泥檢測，具有一定的實用價值，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素的有效管理和控制提供理論依據(jù)和技術支撐。

2 試驗部分

2.1 儀器與試劑

XEVO TQ-S液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；ME204E電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Sorvall ST 16R臺式高速冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Thermo CL31RMultispeed臺式高速冷凍離心機（美國熱電公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；MF10 basic研磨機（德國IKA公司）；KQ-300V型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM）、培氟沙星（Pefloxacin，PEF）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、氟羅沙星（Fleroxacin，F(xiàn)LE）、氘代恩諾沙星（Enrofloxacin-D5，ENR-D5）、氘代環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin-D8，CIP-D8）、氘代諾氟沙星（Norfloxacin-D5，NOR-D5）標準品：純度均>98%，德國Dr Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。上述標準品用甲醇配制成濃度為200μg/L的7種抗生素（ENR、CIP、NOR、LOM、PEF、OFL、FLE）混合標準溶液，再用甲醇配制成200μg/L的3種內(nèi)標（ENR-D5、CIPD8、NOR-D5）混合標準溶液，將所配溶液于4℃避光冷藏保存。

甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；十二水合磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉：國藥化學試劑有限公司產(chǎn)品；無水硫酸鎂：北京伊諾凱科技有限公司；超純水：由Milli-Q型超純水儀制備；磷酸鹽緩沖液：稱取34.6g十二水合磷酸氫二鈉、6.45 g檸檬酸、18.6 g乙二胺四乙酸二鈉，置于燒杯中，用1 mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，用超純水定容至500 mL，即為0.1 mol/L的Na2EDTAMcIlvaine緩沖溶液。

抽取的30個底泥樣品均來自水產(chǎn)養(yǎng)殖場，采樣深度1～2 m，每個底泥樣品約500 g。底泥樣品自然風干后，經(jīng)研磨機研磨后，過100目篩（孔徑為0.15 mm），每份樣品約100 g。制樣完成后防止樣品受到污染或殘留物含量發(fā)生變化，放置于密閉玻璃瓶中置于-18℃下冷凍保存。

2.2 樣品前處理

準確稱取1.00 g底泥樣品（精確到0.01 g）置于50 mL離心管中，加入300μg/L內(nèi)標物質(zhì)，靜置1 h，加入5 mL 0.1 mol/L的Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液，渦旋1 min，再加入20 mL乙腈，渦旋1 min后，25℃超聲提取10 min，加入2.0 g無水MgSO4，渦旋1 min，以4 000 r/min離心5 min；移取上清液于100 mL的雞心瓶中，40℃旋蒸至干。加入1 mL 20%甲醇溶液復溶，渦旋1 min，過0.22μm有機相濾膜于2 mL樣品瓶中，UPLC-MS/MS測定。

2.3 實驗條件

2.3.1色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，粒徑1.7μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）+甲醇（B），梯度洗脫條件見表1；流速：0.3 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：5.0μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.3.2質(zhì)譜條件

電離方式：ESI（+）；離子源：大氣壓電噴霧離子源；掃描方式：多反應監(jiān)測掃描；離子源溫度：550℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；脫溶劑氣溫度：500℃；錐孔氣體流速：150 L/hr；碰撞氣體流速：0.18 mL/min，其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

表2 7種氟喹諾酮類及3種內(nèi)標物的UPLC-MS/MS質(zhì)譜測定參數(shù)

在流動注射狀態(tài)下，將7種FQs及3種內(nèi)標的標準品分別配制成0.1mg/L的甲醇溶液，通過全掃描（Scan模式）確定［M+1］質(zhì)子化離子峰（母離子）m/z。二級質(zhì)譜分析（子離子掃描）得到各自碎片離子的信息，選取碎片離子峰值相對較高的2個碎片離子作為定量離子和定性離子。Intelistart自動優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)。Q：定量離子，q：定性離子。

3 結果與討論

3.1 色譜分析條件的確定

氟喹諾酮類藥物具有兩性基團，屬于酸堿兩性化合物，在水溶液中通常以離子形式存在，易與色譜柱內(nèi)硅膠殘留的硅醇基作用，從而造成色譜峰拖尾、峰形異常和保留值不穩(wěn)定[3]。本文比較了不同品牌的色譜柱，最終選用ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）作為FQs的色譜分離柱，能夠在8.0 min內(nèi)完成色譜柱平衡和目標物的分離，分離度較好，峰型尖銳，避免了普通C18柱容易造成的峰形拖尾現(xiàn)象。

3.2 流動相種類和比例的選擇

3.2.1流動相種類的選擇

流動相的種類和比例不僅影響目標化合物的保留時間和峰形，還會影響到目標化合物的離子化效率，從而影響靈敏度。本實驗分別考察了乙腈-水、甲醇-水作為流動相。結果表明，以甲醇-水作為流動相，質(zhì)譜信號提高，峰形對稱。又考察了在甲醇-水中添加不同量的甲酸對質(zhì)譜靈敏度的影響，結果表明在水相中添加0.1%甲酸水溶液，有助于氟喹諾酮類藥物的有效電離，使分子離子峰響應增強。最終選擇采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

3.2.2流動相比例的選擇

由于FQs之間存在著一定的差異，采用等度洗脫很難在短時間內(nèi)達到基線分離，因此采用梯度洗脫方式分離。在實驗中逐漸調(diào)整甲醇初始濃度，結果表明，初始甲醇比例越大，出峰越快，且對7種FQs的分離效果較差，峰型有重疊，而甲醇的初始比例較小時，出峰較慢，后出組分峰形變寬，靈敏度下降。綜合考慮，確定梯度洗脫程序詳見上表1。最終在最佳條件下得到7種FQs的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖（圖1）。

圖1 7種氟喹諾酮類藥物的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖

3.3 樣品提取時緩沖溶液的優(yōu)化

由于氟喹諾酮類藥物為酸堿兩性化合物，在酸性和堿性條件下均可以提取[14]，那么選擇最佳的條件可以更加有效地提取目標化合物。氟喹諾酮類藥物容易與底泥中的金屬離子結合，通過添加Na2EDTAMcIlvaine緩沖溶液，使EDTA與金屬離子形成絡合物，將底泥中的目標化合物游離出來，再添加有機溶劑進行提取。

本實驗選取不同pH（2.0，4.0，9.0，11.0）的EDTA緩沖溶液進行對比試驗，見圖2。結果表明，pH=4.0時，7種FQs提取效果最為明顯，且出峰良好；pH=2.0、11.0時，提取效果較差，pH=9.0時，雖然部分目標物也能提取，但是出峰不明顯，且有雜峰出現(xiàn)干擾。所以本實驗最終選擇pH=4.0的Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液作為樣品提取時的緩沖溶液。

圖2 7種氟喹諾酮類化合物在不同pH Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液下的提取情況

3.4 標準曲線、線性范圍和檢出限

移取適量的7種FQs混合標準溶液，用空白底泥樣品分別配制成不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)標準溶液，目標物濃度分別為5.0、10、20、50、100、200μg/L。以各組分濃度與其色譜峰面積進行線性回歸，結果均呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)均>0.995。以10倍信噪比（S/N）計算定量限LOQ，具體數(shù)值見表3。

表3線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

3.5 方法精密度及加標回收率

稱取底泥的空白樣品1.0 g，對7種FQs進行低、中、高3個不同水平添加，不同組分每個濃度進行3個平行測定，結果見表4。從實驗結果可知在加標量為10、50、100μg/kg的3個梯度下，7種FQs的平均回收率在83.1%～107.5%，相對標準偏差在0.9%～11.7%，結果表明該方法回收率及精密度可以滿足藥殘檢測的要求。

表4 7種氟喹諾酮類藥物的加標回收率（n=6）

3.6 實際樣品檢測

采用本文建立的方法對30個漁場的池塘底泥樣品進行檢測分析，測得池塘底泥中主要是ENR殘留，其檢出率為90%，檢出量為1.52～82.41μg/kg，平均含量為10.27μg/kg；其次是CIP、NOR、OFX，檢出率分別為40%、37%、10%，平均檢出量分別為6.4、3.40、2.02μg/kg；其他藥物均未檢出。

4 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定池塘底泥中7種氟喹諾酮類藥物的殘留方法并對色譜條件、流動相種類和比例、Na2EDTA緩沖溶液pH進行了優(yōu)化，該方法簡便快速，基體干擾小，線性范圍寬，回收率和檢出限均可滿足分析檢測要求，適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘底泥中氟喹諾酮類藥物的殘留監(jiān)控。

該方法實用性強，適合應用于大批量樣品的測定，可作為開展底泥藥物殘留快速篩查的一種有效手段，同時也能夠為水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中氟喹諾酮類藥物的篩查提供數(shù)據(jù)支撐。