徐美鑫 張瀾 相茂花

（日照市場監(jiān)管檢驗(yàn)檢測中心 山東日照276800）

1 前言

實(shí)驗(yàn)室引入標(biāo)準(zhǔn)方法前，應(yīng)對其能否正確運(yùn)用這些方法的能力進(jìn)行驗(yàn)證，并保存驗(yàn)證記錄。驗(yàn)證不僅需要識別相應(yīng)的人員、設(shè)施、環(huán)境、設(shè)備等條件是否滿足要求，還應(yīng)通過試驗(yàn)證明該方法可以滿足標(biāo)準(zhǔn)的要求。因此，實(shí)驗(yàn)室在將方法引入檢測之前，應(yīng)從“人”“機(jī)”“料”“法”“環(huán)”等方面驗(yàn)證其是否有能力按照標(biāo)準(zhǔn)方法開展檢測活動(dòng)。例如，人員是否經(jīng)過有效培訓(xùn)并具備相關(guān)知識和能力；儀器設(shè)備是否滿足標(biāo)準(zhǔn)要求，并處于檢定或校準(zhǔn)的有效期內(nèi)；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和關(guān)鍵試劑是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求；設(shè)施和環(huán)境條件是否滿足標(biāo)準(zhǔn)要求；檢驗(yàn)原始記錄是否規(guī)范、適用等，且應(yīng)當(dāng)附有證明記錄。在滿足上述條件之后，還應(yīng)通過試驗(yàn)證明結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

因此，一份合格的方法驗(yàn)證報(bào)告不僅是實(shí)驗(yàn)室具備開展檢測資質(zhì)能力的證明，同時(shí)也能夠證明檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。本文按照RB/T《基因擴(kuò)增檢測方法確認(rèn)與驗(yàn)證指南》要求，以雞源性成分為例研究了GB/T 38164-2019《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》方法驗(yàn)證的具體執(zhí)行方式及各參數(shù)的評價(jià)方法，有助于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員更好地理解方法驗(yàn)證，并給予基因擴(kuò)增檢測領(lǐng)域的方法驗(yàn)證工作的一些參考。

2 材料

2.1 試驗(yàn)樣品

現(xiàn)殺整雞、雞胸肉、雞腿、鹵雞爪、烤翅中、炸雞叉骨、鹵雞肝、雞肉火腿腸、陽光玉米腸、加鈣火腿腸、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、豬肉、牛肉、羊肉、馬肉、玉米、大豆、花生均為超市購買。

2.2 主要試劑

動(dòng)物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒（DP323-02）（天根生化）。

雞種特異性基因測定試劑盒（熒光PCR法）（上海之江）。

2.3 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)（賽默飛Micro17R）；超微量紫外分光光度計(jì)（mettler UV5Nano）；熒光定量PCR儀（lightCycler 96）；微量移液器：10μL、100μL、1 000 μL（eppendorf）。

3 方法

3.1 方法驗(yàn)證參數(shù)

按照RB/T 032-2020《基因擴(kuò)增檢測方法確認(rèn)與驗(yàn)證指南》要求，并參考RB/T 004-2019《轉(zhuǎn)基因檢測方法驗(yàn)證指南》[2]，以雞源性成分為例研究GB 38164-2019《常見畜禽動(dòng)物源性成分》方法驗(yàn)證，驗(yàn)證了該方法的DNA提取效果評價(jià)、重復(fù)性、檢出限和基質(zhì)效應(yīng)。

3.2 DNA提取質(zhì)量

使用DNA提取試劑盒對現(xiàn)殺整雞進(jìn)行DNA提取，PCR體系配制及反應(yīng)參數(shù)按照雞種特異性基因測定試劑盒進(jìn)行操作。

以雞的DNA提取物為起始工作液，并將此工作液進(jìn)行4倍系列稀釋（1∶4、1∶16、1∶64、1∶256），獲得4份稀釋液。將這5份DNA樣品溶液進(jìn)行擴(kuò)增分析，每個(gè)濃度做2個(gè)PCR平行試驗(yàn)，以稀釋因子的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（即-lg1/4、-lg1/16、-lg 1/64、-lg1/256），對應(yīng)的平均Ct值為縱坐標(biāo)，得出斜率、線性相關(guān)系數(shù)、ΔCt值（起始工作液測量Ct值與通過標(biāo)準(zhǔn)曲線外推法獲得的定量循環(huán)數(shù)的差值）。

3.3 重復(fù)性

對于基因擴(kuò)增反應(yīng)來說，方法的重復(fù)性的評估采用同一實(shí)驗(yàn)室檢測相同樣品，獲得相同結(jié)果的比率表征。在同一實(shí)驗(yàn)室由同一操作者，檢測條件和日常檢測一致，對同一樣品（現(xiàn)殺整雞）進(jìn)行DNA提取，平行提取2次；以雞的DNA提取物為起始工作液進(jìn)行系列稀釋至10%、1%、0.5%、0.2%、0.1%（含有接近檢出限水平），將每個(gè)稀釋液進(jìn)行4個(gè)平行PCR擴(kuò)增；重復(fù)試驗(yàn)1次，每個(gè)稀釋液得到16個(gè)獨(dú)立測量的結(jié)果。

3.4 檢出限

使用終點(diǎn)稀釋法，對雞的DNA提取物進(jìn)行系列稀釋至10%、1%、0.5%、0.2%、0.1%，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，5%以上樣品檢測不到目標(biāo)物的稀釋濃度就是該方法的檢出限。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)

對于定性方法，采用了未加工過、初加工的和深加工過的雞制品等10份作為陽性樣本，用其他禽類、畜類和植物類等10份為陰性樣本，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

4 結(jié)果與分析

4.1 DNA提取效果評價(jià)

抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)可以通過與DNA模板反應(yīng)、干擾DNA聚合酶活性或降低聚合酶輔助因子（Mg2+）的效率而影響目標(biāo)DNA擴(kuò)增的效率。DNA提取步驟可以在很大程度上消除或降低PCR抑制物的量，因此DNA提取效果可以用檢測DNA提取物中抑制劑的方式進(jìn)行評價(jià)。

RB/T 032-2020《基因擴(kuò)增檢測方法確認(rèn)與驗(yàn)證指南》要求，以稀釋因子的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（即-lg1/4、-lg1/16、-lg1/64、-lg1/256），對應(yīng)的平均Ct值為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率在-3.6到-3.1之間，線性相關(guān)系數(shù)大于0.98；工作液推導(dǎo)Ct值與測量Ct之差ΔCt值小于0.5；即說明DNA提取物中無抑制劑影響。

如圖1和表1所示，曲線斜率為-3.3461，相關(guān)系數(shù)R2為0.99，工作液推導(dǎo)Ct值與測量Ct之差ΔCt為0.11小于0.5，滿足RB/T 032-2020的要求[1]。證明天根生化的動(dòng)物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒提取的產(chǎn)物不含抑制劑，提取效果合格，可以用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

表1 DNA提取物中抑制劑檢測

圖1 4個(gè)系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.2 重復(fù)性

重復(fù)性是指實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度，即同一實(shí)驗(yàn)室在相同條件下獲得一系列結(jié)果的一致性程度。采用相對重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDr）來衡量精密度工具，當(dāng)RSD≤25%時(shí)證明重復(fù)性較好。

如表2所示，含量為0.1%和0.01%雞種DNA樣品未能全部測出Ct值，其余4個(gè)濃度均能測出，且相對重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr值分別為1.35%、1.32%、1.63%、1.58%，均＜25%，證明其重復(fù)性較好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

4.3 檢出限

通過量化樣品中核酸的最小檢測量來評估檢出限，如通過已知濃度的被分析物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行有限稀釋獲得。當(dāng)缺乏已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，可使用終點(diǎn)稀釋法，對目標(biāo)分析物進(jìn)行系列稀釋，直到該稀釋度中5%以上樣品檢測不到目標(biāo)物，此時(shí)的稀釋濃度就是方法檢出限。

不同含量的雞種DNA樣品16個(gè)檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：含量為0.01%的樣品絕大多數(shù)未檢出且擴(kuò)增曲線不明顯；含量為0.1%的雞種DNA樣品有1個(gè)未檢出目的基因，占整個(gè)樣品的6.25%；故0.1%為該方法的檢出限，滿足GB/T 38164-2019《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》中雞源性成分的檢出限1%的要求。

4.4 基質(zhì)效應(yīng)

對于定性方法，采用了未加工過的現(xiàn)殺整雞、雞胸肉、雞腿；初加工的鹵雞爪、烤翅中、炸雞叉骨、鹵雞肝；深加工過的雞肉火腿腸、陽光玉米腸和加鈣火腿腸等10份作為陽性樣本，用近緣的禽類鴨肉、鵝肉、鴿子肉；畜類豬肉、牛肉、羊肉、馬肉；植物類玉米、大豆、花生等10份為陰性樣本，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

結(jié)果見圖2，雞肉及其制品的陽性樣本均有明顯的擴(kuò)增曲線，而其他陰性樣本則無擴(kuò)增曲線，與預(yù)期相符。使用上海之江的雞種特異性基因測定試劑盒具有良好的特異性，與上述物種沒有交叉反應(yīng)，可以忽略基質(zhì)效應(yīng)對未知樣品檢測結(jié)果的影響。

圖2 20種樣本的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增圖譜

5 結(jié)論

本文通過實(shí)例闡述了GB/T 38164-2019《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》的方法驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明：DNA提取效果良好，不存在抑制劑；該方法重復(fù)性較好；基質(zhì)效應(yīng)無影響；檢出限為0.1%，均滿足GB/T 38164-2019的要求。證明實(shí)驗(yàn)室可以按照GB/T 38164-2019《常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》開展動(dòng)物源性成分檢測[3]，同時(shí)本文也為相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行方法驗(yàn)證提供了參考。