鄧云兵,黃冬琴,岳天翔
(江西中醫(yī)藥大學(xué),江西南昌 330038)
淡竹葉為禾本科淡竹葉屬的植物淡竹葉(Lophatherum gracileBrongn.)的莖葉,富含多糖、黃酮、多酚等生物活性物質(zhì),具有清心除煩、生津止咳的功效[1?2],常用于涼茶、飲料等食品的生產(chǎn)?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,多糖化合物可增強(qiáng)體內(nèi)超氧化物歧化酶活性,延緩端??s短速度,同時(shí)提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力,使得體內(nèi)過(guò)氧化物的清除速度加快,減少有害產(chǎn)物丙二醛的累積,具有抗衰老、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體耐力等生物學(xué)活性[3?4],如:Xie 等發(fā)現(xiàn)黨參多糖可明顯延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間[5];Zhang 等通過(guò)色譜柱純化得到的斜紋夜蛾多糖可明顯降低運(yùn)動(dòng)后血液乳酸、尿素氮和乳酸脫氫酶的水平[6]。
運(yùn)動(dòng)性疲勞通常源于機(jī)體運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的大量活性氧自由基,使得體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激,造成組織損傷和肌肉收縮能力的下降[7?8]。由于目前淡竹葉多糖研究多集中于提取條件優(yōu)化和抗氧化活性探討[9?10],暫未有文獻(xiàn)討論其對(duì)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力的影響,同時(shí)提取產(chǎn)物中仍含有蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì),可能影響其活性的發(fā)揮,為此本研究利用大孔樹(shù)脂吸附分離具有機(jī)械篩分與化學(xué)吸附的特性[11?12],探討其純化淡竹葉多糖提取物的最佳工藝條件,同時(shí)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),觀察其對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響,從而為相關(guān)運(yùn)動(dòng)食品的開(kāi)發(fā)提供參考。
淡竹葉 購(gòu)自江西昌盛大藥房,經(jīng)鑒定為禾本科植物淡竹葉的葉片;西洋參口服液 金日制藥(中國(guó))有限公司;濃硫酸、苯酚、葡萄糖 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乳酸 (Blood lactic acid,BLA)、乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase,LDH)、尿素氮 (Blood urea nitrogen,BUN)試劑盒 南京信帆生物有限公司;純化水 制于Millipore 超純水機(jī);SPF 級(jí)健康雄性昆明小鼠 100 只,體質(zhì)量15~22 g,由江西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 (許可證號(hào):SYXK 2018-0006)。
DX-30B 型粉碎機(jī) 廣州祥明機(jī)械設(shè)備有限公司;721 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;FA2104J 型電子天平 上海恒平科技有限公司;SM-150D 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 南京舜瑪科技有限公司;RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;LC-10N-50A 型冷凍干燥箱 上海力辰儀器制造有限公司;TG-15 型高速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司;SHA-C 型恒溫振蕩器 國(guó)華(常州)儀器制造有限公司;AB-8、H-103、D-101 型大孔樹(shù)脂 天津浩聚樹(shù)脂科技有限公司;HPD 300、HPD 400 型大孔樹(shù)脂 北京索萊寶科技有限公司;DM 301、NKA-9 型大孔樹(shù)脂 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;動(dòng)物恒溫游泳池 上海艾研生物科技有限公司。
1.2.1 多糖提取物制備 淡竹葉經(jīng)烘干后粉碎,過(guò)80 目篩,以水作提取溶劑,在固液比1:35 的條件下于200 W、50 ℃下,超聲提取30 min 后過(guò)濾,濾渣再次提取,合并兩次濾液,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮,經(jīng)無(wú)水乙醇沉淀后抽濾,冷凍干燥即得[13]。
1.2.2 多糖含量測(cè)定 稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,先后加入5%苯酚溶液和濃硫酸處理后,于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值[14],隨后以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:y=1.013x?0.0206(r=0.9954),表明葡萄糖濃度在0.1~1.0 mg/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,另于相同波長(zhǎng)測(cè)定樣品的吸光度,平行測(cè)定六次,通過(guò)下式計(jì)算樣品的多糖純度。
式中:c 為多糖質(zhì)量濃度,mg/mL;V 為樣品溶液體積,mL;m0為樣品質(zhì)量,mg;D 為稀釋倍數(shù)。
1.2.3 大孔樹(shù)脂型號(hào)篩選 經(jīng)預(yù)處理后的2.0 g 不同型號(hào)樹(shù)脂置于150 mL 具塞錐形瓶?jī)?nèi),分別加入30 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL 多糖提取液,于25 ℃振蕩吸附12 h 后過(guò)濾,測(cè)得上清液的多糖質(zhì)量濃度,通過(guò)下式計(jì)算樹(shù)脂的吸附率[15]。
式中:c0為提取液中多糖濃度,mg/mL;ce為飽和吸附后上清液中多糖濃度,mg/mL;Qe為吸附率,%。
吸附后的大孔樹(shù)脂經(jīng)過(guò)濾后,加入100 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液,于相同條件靜態(tài)洗脫12 h后,測(cè)得上清液的多糖濃度,通過(guò)下式計(jì)算洗脫率與回收率[16]。
式中:c0為提取液中多糖濃度,mg/mL;ce為飽和吸附后上清液中多糖濃度,mg/mL;cd為洗脫液中多糖濃度,mg/mL;V0為提取液體積,mL;Vd為洗脫液體積,mL;Dd為洗脫率,%;R 為回收率,%。
1.2.4 樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸動(dòng)力學(xué)曲線 將預(yù)處理后的2.0 g AB-8 型大孔樹(shù)脂置于150 mL 具塞錐形瓶?jī)?nèi),加入30 mL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL 多糖提取液后振蕩吸附,于不同時(shí)間測(cè)定上清液的多糖濃度后,繪制靜態(tài)吸附曲線,隨后過(guò)濾,另加入100 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液,振蕩洗脫,測(cè)得不同時(shí)間上清液的多糖質(zhì)量濃度,繪制樹(shù)脂的靜態(tài)洗脫曲線,另利用用不同動(dòng)力學(xué)模型研究AB-8 型樹(shù)脂對(duì)淡竹葉多糖的吸附機(jī)制。
式中:K1為準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù),min?1;K2為準(zhǔn)二級(jí)速率常數(shù),mL?mg?1·min?1;τt為多糖吸附量,mg/g;τe為多糖飽和吸附量,mg/g。
1.2.5 樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-洗脫條件考察
1.2.5.1 不同吸附條件考察 分別考察上樣質(zhì)量濃度、樣液pH、上樣體積及上樣流速對(duì)樹(shù)脂的吸附率影響,具體如下:當(dāng)樣液pH 為5.0,上樣流速為2 mL/min,上樣液體積為60 mL 時(shí),上樣質(zhì)量濃度分別為:1、3、5、7、9 mg/mL;當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL,上樣流速為2 mL/min,上樣液體積為60 mL 時(shí),樣液pH 分別為:3.0、4.0、5.0、6.0、7.0;當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL,樣液pH 為5.0 時(shí),繪制上樣流速分別為1、2、3 mL/min 的泄漏曲線。
1.2.5.2 不同洗脫條件考察 以乙醇溶液作洗脫液,分別考察洗脫液體積分?jǐn)?shù)、體積和洗脫流速對(duì)目標(biāo)化合物解吸的效果影響,具體如下:當(dāng)洗脫流速為1 mL/min,洗脫液體積160 mL 時(shí),洗脫液體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%;當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)80%時(shí),繪制洗脫流速分別為1、2、3 mL/min時(shí)洗脫曲線。
1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
1.2.6.1 分組與劑量設(shè)計(jì) 100 只健康雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后(飼養(yǎng)環(huán)境溫度:20~25 ℃,相對(duì)濕度:50%~70%),按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組,即空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量組,每組各20 只,根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)》要求,設(shè)計(jì)人體推薦攝入劑量的10、20、30 倍,作為低、中、高劑量組動(dòng)物每日淡竹葉多糖純化物的攝入量,即0.10、0.20、0.30 mg/g/d,空白對(duì)照組則給予生理鹽水,陽(yáng)性對(duì)照組則給予西洋參口服液(2 mg/mL),各組動(dòng)物均按照0.2 mL/g 體重灌胃,全部動(dòng)物每天灌胃1 次,連續(xù)灌胃30 d,灌胃期間可自由喂食與飲水[17?18]。
1.2.6.2 力竭游泳時(shí)間 末次灌胃后,各組動(dòng)物于鼠尾負(fù)重5%體質(zhì)量重物,置于(25±2)℃游泳池內(nèi)開(kāi)展負(fù)重游泳試驗(yàn),記錄小鼠自入水開(kāi)始游泳至沉沒(méi)超過(guò)10 s 的時(shí)間[19]。
1.2.6.3 生化指標(biāo)測(cè)定 末次灌胃結(jié)束后,各組剩余動(dòng)物游泳30 min,取出擦凈,休息10 min 后,于眼底取血,離心,制備血清,照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求,檢測(cè)各組小鼠血清中BLA 與BUN 的含量及LDH活力[20]。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述,利用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析,不同組間的比較采用方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,當(dāng)P<0.05 判斷為差異顯著,P<0.01 判斷為差異極顯著。
不同型號(hào)的樹(shù)脂的比表面積和極性不同,因此對(duì)目標(biāo)化合物的吸附與解吸效果存在較大差異,分別考察不同類型大孔樹(shù)脂的吸附與解吸效果,結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn),H 103 型大孔樹(shù)脂對(duì)多糖化合物的解吸率僅為51.6%,這歸因于該樹(shù)脂的比表面積較大,吸附位點(diǎn)較多,而多糖化合物具有弱極性,因此較難解吸,HPD-300 型大孔樹(shù)脂的吸附率雖達(dá)到88.2%,但解吸率僅為68.6%,而AB-8 型大孔樹(shù)脂比表面積適中,且回收率達(dá)到74.5%,因此確定采用AB-8 型大孔樹(shù)脂純化淡竹葉多糖提取物。
表1 不同類型大孔樹(shù)脂的吸附與解吸效果Table 1 Adsorption and desorption performance of different types of macroporous resins
圖1為AB-8 型大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附曲線,從圖1可知,該吸附過(guò)程為中速平衡型,在前4 h 樹(shù)脂的吸附率增長(zhǎng)較快,隨后逐漸緩慢,至8 h 后基本不再變化達(dá)到平衡,因此該樹(shù)脂對(duì)淡竹葉多糖的靜態(tài)吸附時(shí)間為8 h。圖2為AB-8 型大孔樹(shù)脂的靜態(tài)洗脫曲線,從圖2可知,該解吸過(guò)程為快速平衡型,前3 h洗脫率迅速增大,隨后趨于穩(wěn)定,達(dá)到平衡。采用一級(jí)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型分別擬合上述吸附過(guò)程,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知,采用二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合方程的相關(guān)系數(shù)較大,因此該吸附過(guò)程更接近于二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型特征,吸附過(guò)程可能受到外部擴(kuò)散、邊界層擴(kuò)散或顆粒內(nèi)擴(kuò)散控制。
表2 吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合參數(shù)Table 2 The fitting parameters of adsorption kinetics models
圖1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 The static adsorption kinetics curve
圖2 靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 The static desorption kinetics curve
不同上樣質(zhì)量濃度對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響,見(jiàn)圖3所示。從圖3可見(jiàn),隨著上樣質(zhì)量濃度的增大,樹(shù)脂的吸附率先升高后降低,這歸因于當(dāng)上樣質(zhì)量濃度較低時(shí),樹(shù)脂的吸附位點(diǎn)較多,而隨著濃度不斷增大,樣品中雜質(zhì)的含量亦逐漸增加,不僅易堵塞樹(shù)脂,同時(shí)可與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)吸附活性位點(diǎn)[21],因此確定最佳上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL。
圖3 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of sample concentration on the adsorption rate
不同樣液的pH 對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響,見(jiàn)圖4。從圖4可知,隨著樣液pH 的升高,樹(shù)脂對(duì)多糖的吸附率呈先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)樣液pH 為5.0 時(shí),吸附率達(dá)到最大,這可能源于多糖類化合物在酸、堿條件下均易發(fā)生水解反應(yīng),從而影響目標(biāo)化合物的溶解度與化學(xué)性質(zhì)[22],而溶液處于弱酸性時(shí),多糖更易于被樹(shù)脂吸附,這與陳艷等利用大孔樹(shù)脂純化松茸多糖研究結(jié)論一致[23],因此確定樣液最佳pH 為5.0。
圖4 樣液pH 對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effect of pH value of sample solution on the adsorption rate
隨著上樣液體積的不斷增大,樹(shù)脂的吸附位點(diǎn)逐漸飽和,從而吸附能力不斷下降,使得流出液中多糖濃度持續(xù)升高,若流出液中多糖濃度約為上樣質(zhì)量濃度的10%,則認(rèn)為樹(shù)脂已吸附飽和并出現(xiàn)泄漏[24],若上樣液體積過(guò)大且流速過(guò)快,不僅使得目標(biāo)化合物無(wú)法與樹(shù)脂充分接觸,也容易出現(xiàn)樹(shù)脂過(guò)載,因此分別考察不同上樣流速的樹(shù)脂泄露曲線,結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可知,隨著上樣液體積的增多,流出液中多糖濃度不斷增大,樹(shù)脂最終達(dá)到飽和吸附,另外隨著流速加快,樹(shù)脂開(kāi)始泄漏時(shí)的上樣液體積不斷減少,結(jié)合實(shí)際吸附效率,確定最佳上樣流速為2.0 mL/min,上樣液體積為60 mL。
圖5 不同上樣流速的泄漏曲線Fig.5 The leakage curve in different loading speed
圖6為不同洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響,當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)增大至80%后,洗脫率開(kāi)始下降,這歸因于洗脫液的體積分?jǐn)?shù)過(guò)低或過(guò)高,其極性均與目標(biāo)化合物相差較大,不能破壞樹(shù)脂與多糖形成的氫鍵[25],同時(shí)其它吸附雜質(zhì)也會(huì)競(jìng)爭(zhēng)脫附,致使洗脫率降低,因此確定洗脫液的體積分?jǐn)?shù)為80%。
圖6 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響Fig.6 The effect of volume fraction of eluent on the desorption rate
洗脫流速過(guò)快會(huì)使洗脫液與樹(shù)脂接觸不充分,為此考察飽和吸附后的樹(shù)脂在不同洗脫流速下的解吸曲線,結(jié)果見(jiàn)圖7。從圖7可知,洗脫流速過(guò)大,曲線峰型逐漸變寬、拖尾嚴(yán)重,且用量增多,當(dāng)采用80%乙醇以1.0 mL/min 流速洗脫飽和吸附樹(shù)脂后,洗脫曲線單一、對(duì)稱、尖銳,且無(wú)明顯拖尾,因此確定最佳洗脫流速為1.0 mL/min,洗脫液用量160 mL。
圖7 不同洗脫流速的解吸曲線Fig.7 The dynamic desorption curve in different flow rate of elution
按照上述試驗(yàn)確定的最佳純化工藝,即配制體積為60 mL,pH5,質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液,以2.0 mL/min 流速,上樣至AB-8 型大孔樹(shù)脂飽和吸附后,采用體積為160 mL 80%乙醇溶液,以1.0 mL/min 流速洗脫,產(chǎn)物的多糖純度由16.39%±1.06%提高至 57.37%±1.72%,約為純化前3.5 倍。
2.9.1 淡竹葉多糖對(duì)力竭游泳時(shí)間影響 負(fù)重游泳試驗(yàn)是考察動(dòng)物運(yùn)動(dòng)耐力的常用模型,通過(guò)力竭游泳時(shí)間的測(cè)定,可客觀反映淡竹葉多糖對(duì)機(jī)體疲勞緩解的效果,各組小鼠的力竭游泳時(shí)間結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知,與空白對(duì)照組相比,中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均顯著延長(zhǎng)動(dòng)物的力竭游泳時(shí)間,其中,中劑量組差異顯著(P<0.05),而高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組差異極顯著(P<0.01),表明中、高劑量淡竹葉多糖有助于提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力,延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間,另外高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組具有極顯著性差異(P<0.01)。
表3 淡竹葉多糖對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響Table 3 The effect of polysaccharides of Lophatherum gracile Brongn.on exhaustive swimming time of mice
2.9.2 淡竹葉多糖對(duì)BLA 和LDH 的影響 高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)供氧不足,部分血糖轉(zhuǎn)化成乳酸,造成四肢肌肉酸痛,而乳酸脫氫酶有利于催化乳酸脫氫形成丙酮酸,減少體內(nèi)乳酸累積[26],淡竹葉多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠血清BLA 和LDH 的影響,見(jiàn)表4。從表4可知,與空白對(duì)照組相比,中、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的BLA 濃度均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05,P<0.01),而LDH 活力則有顯著提高 (P<0.05,P<0.01),表明中、高劑量淡竹葉多糖有利于明顯增強(qiáng)乳酸脫氫酶活力,減小體內(nèi)乳酸含量,高劑量組BLA 濃度和LDH 活力較陽(yáng)性對(duì)照組具有顯著性差異 (P<0.05)。
表4 淡竹葉多糖對(duì)BLA 和LDH 的影響Table 4 The effect of polysaccharides of Lophatherum gracile Brongn.on BLA and LDH
2.9.3 淡竹葉多糖對(duì)體內(nèi)尿素氮含量影響 當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng),血糖供應(yīng)不足,超出體力負(fù)荷承載能力時(shí),體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝加快,以補(bǔ)充額外能量,使得代謝產(chǎn)物尿素氮含量迅速增大[27],淡竹葉多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠血清尿素氮含量的影響見(jiàn)表5。從表5可知,與空白對(duì)照組相比,中、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的BUN 濃度均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05,P<0.01),表明中、高劑量組可減少運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解利用,但高劑量組的BUN 濃度與陽(yáng)性對(duì)照組相較,差異具有顯著性 (P<0.05)。
表5 淡竹葉多糖對(duì)BUN 的影響Table 5 The effect of polysaccharides of Lophatherum gracile Brongn.on BUN
隨著對(duì)可食用性植物有效成分的生物活性研究不斷深入,諸如:多糖、黃酮、皂苷類物質(zhì),被發(fā)現(xiàn)對(duì)活性氧自由基具有較強(qiáng)清除能力,而機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)易導(dǎo)致活性氧自由基積累,引發(fā)軀體性疲勞,為此本研究探討了大孔樹(shù)脂純化淡竹葉多糖的最佳工藝條件并分析其對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力影響。當(dāng)配制體積為60 mL,pH5,質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液,以2 mL/min 流速,上樣至AB-8 型大孔樹(shù)脂飽和吸附后,采用體積為160 mL 80%乙醇溶液,以1 mL/min 流速洗脫,產(chǎn)物的多糖純度由16.39%提高至57.37%,約為純化前3.5 倍。孫偉曾采用D101大孔樹(shù)脂純化桑白皮多糖,產(chǎn)物純度約為純化前4.6 倍[28],而張洪坤曾采用AB-8 大孔樹(shù)脂純化茯苓多糖,產(chǎn)物純度為約為純化前3.2 倍[29],表明該工藝分離純化效果較好,適于淡竹葉多糖提取物的純化。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,淡竹葉多糖的劑量與增強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力呈正相關(guān),隨著多糖劑量的增大,有助于延長(zhǎng)小鼠的游泳力竭時(shí)間,提高體內(nèi)乳酸脫氫酶活性,從而加快體內(nèi)乳酸代謝,減小對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響,同時(shí)避免了蛋白質(zhì)與氨基酸的分解代謝,這與焦迎春等研究柴達(dá)木大肥菇多糖的抗疲勞活性結(jié)果基本一致[30]。本研究可為淡竹葉多糖增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力的功能性食品開(kāi)發(fā)提供參考,促進(jìn)該資源的開(kāi)發(fā)利用,但其具體的抗疲勞機(jī)制和人體安全劑量尚需進(jìn)一步研究。