趙起越，鞠馨瑤，吳 超，徐獻(xiàn)兵,*，杜 明,*

（1.海洋食品深加工省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116034）

鱈魚加工后，大約占魚重15%的魚骨作為廢棄物處理，帶來(lái)了重大經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境污染等問(wèn)題[1]。有研究表明，鱈魚骨中富含35.8%的蛋白質(zhì)，而脂肪含量?jī)H有1%，說(shuō)明鱈魚骨是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白源加工原材料[2]。近年來(lái)，通過(guò)酶制劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的回收利用技術(shù)愈發(fā)成熟，相比于其他水解方法，酶水解具有高效、安全、便捷等特點(diǎn)[3]。一些研究針對(duì)不同蛋白原料提出了各種酶解配方和技術(shù)，但酶解不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致苦味的產(chǎn)生從而影響食品的口感和品質(zhì)，該問(wèn)題一直困擾著蛋白酶解技術(shù)在食品產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中的普遍推廣應(yīng)用[4]。理論上苦味的產(chǎn)生與疏水氨基酸的暴露程度有關(guān)，控制蛋白酶解過(guò)程中疏水性氨基酸的暴露有望減少酶解液苦味的產(chǎn)生[5?6]。許多文獻(xiàn)報(bào)道了酶解動(dòng)物骨生產(chǎn)酶解肽的研究[7]，而對(duì)于鱈魚骨酶解的研究，范巍巍等[8]在同等條件下使用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶分別對(duì)鱈魚骨進(jìn)行水解，木瓜蛋白酶獲得的水解物產(chǎn)生的苦味最低。但是針對(duì)酶解技術(shù)的特異性，直接應(yīng)用相關(guān)酶解技術(shù)參數(shù)和配方酶解鱈魚骨無(wú)法得到滿意產(chǎn)品，本研究主要針對(duì)鱈魚骨這一特有蛋白原料開(kāi)發(fā)低苦味酶解肽，目前沒(méi)有相關(guān)技術(shù)報(bào)道。

本文以鱈魚骨為原料，通過(guò)適度水解和深度水解的方法，以電子舌測(cè)定的苦味值為指標(biāo)，監(jiān)測(cè)酶解物苦味的產(chǎn)生。同時(shí)采用納升液相串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Nano-LC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)對(duì)不同酶解多肽進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)鑒定，建立多肽結(jié)構(gòu)與苦味形成的關(guān)系，為低苦鱈魚骨多肽產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)指導(dǎo)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰凍鱈魚骨 青島益和興食品有限公司；木瓜蛋白酶（1×104U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；堿性蛋白酶（2×105U/g） 北京索萊寶科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶（5×104U/g） 諾維信中國(guó)生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（5×104U/g） 美國(guó)Sigma 公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS） 上海吉至生化科技有限公司。

CF16RXⅡ高速離心機(jī)、LA8080 氨基酸自動(dòng)分析儀、SU8010 冷凍掃描電鏡 日本Hitachi 公司；YXQ-LS-50G 自動(dòng)電壓力滅菌鍋 上海博訊有限公司；RLPHR1-4 真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；UDK129 自動(dòng)凱氏定氮儀 北京盈盛泰科技有限公司；TS-5000Z 電子舌 日本Insent 公司；ImpactⅡQ-TOF 質(zhì)譜儀 布魯克科技有限公司；EASY-Nlc 1200 納升液相 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鱈魚骨蛋白的水解 鱈魚骨水解的工藝流程見(jiàn)圖1。

圖1 鱈魚骨水解的工藝流程Fig.1 The process flow diagram of cod bone hydrolysis

1.2.2 水解度的測(cè)定 參考周慧江等[9]的方法，將水解上清液稀釋100 倍，取100 μL 稀釋液加入試管中，添加900 μL 的磷酸鹽緩沖液（pH8.2）補(bǔ)充至1 mL，加入2 mL 的TNBS（0.05%）溶液，振蕩混勻后避光在50 ℃下反應(yīng)60 min，加入4 mL 的0.1 mol/L HCl 終止反應(yīng)后，在340 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以L-亮氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0～60 mmol/L范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合的線性方程為：y=0.0112x+0.0892，R2=0.9991。x 為氨基質(zhì)量濃度（mmol/L），y 為吸光值。

式中：DH 為水解度（%）；AN1為蛋白水解前氨基氮含量（mmoL/g）；AN2為蛋白水解后氨基氮含量（mmol/g）；Npb為蛋白底物中肽鍵氮含量（mmol/g）。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 根據(jù)GB5009.5-2010[10]方法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

1.2.4 冷場(chǎng)掃描電鏡 將5 μg 酶解后的鱈魚骨凍干粉末均勻涂抹在膠條上，并貼在樣品臺(tái)上，噴金后在真空下通過(guò)氣鎖傳送裝置轉(zhuǎn)移到艙室中心，并在觀察前以80 kV 的電壓進(jìn)行傳導(dǎo)，在5 kV 的電壓下獲得掃描電子顯微鏡圖像。

1.2.5 電子舌的測(cè)定 取30 mL 水解上清液放置在樣品杯中，電子舌開(kāi)始測(cè)定前，對(duì)鮮味（AAE）、咸味（CTO）、酸味（CAO）、苦味（COO）和澀味（AE1）這五種電極傳感器進(jìn)行24 h 的活化，然后將傳感器完全浸入到樣品杯中進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定三次取平均值。

1.2.6 游離氨基酸的測(cè)定 將水解上清液以10000×g離心10 min 除去不溶物，然后加入等體積的丙酮，并以10000×g 再次離心除去大蛋白，干燥后加入同等體積的0.02 mol/L HCl，通過(guò)0.20 μm 的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。處理過(guò)的樣品通過(guò)Hitachi 高性能陽(yáng)離子交換柱（柱溫57 ℃）進(jìn)行分析,衍生溫度135 ℃，流動(dòng)相流速為1 mL/min。

1.2.7 多肽序列的測(cè)定 水解產(chǎn)物用Cleanert S C18-SPE 色譜柱進(jìn)行脫鹽處理[11]，將脫鹽的水解物干燥后溶解在0.1%的甲酸水中。載有4 μL 的樣品通過(guò)納升液相上的PepMap C18柱（2 μm，50 μm×15 cm）進(jìn)行分離，流速為20 μL/min。流動(dòng)相A 為超純水，流動(dòng)相B 為80%的乙腈，分別向A 相和B 相中添加0.1%甲酸。0～82 min 時(shí)，流動(dòng)相B 從9%增加至90%；82～90 min 時(shí)，流動(dòng)相B 從90%降至2%；90～95 min 時(shí)，流動(dòng)相B 從2%增加至9%。洗脫后，通過(guò)Q-TOF-MS/MS 質(zhì)譜鑒定分離出的化合物。峰的標(biāo)記和肽段的鑒定通過(guò)Mascot v1.4.0.38軟件進(jìn)行。分析質(zhì)荷比范圍為50～2200。每個(gè)樣品進(jìn)行三次重復(fù)分析。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，各組數(shù)據(jù)均取平均值，P<0.05 表示差異顯著。所有數(shù)據(jù)均使用Origin 8.5 軟件分析數(shù)據(jù)并作圖。每組數(shù)據(jù)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱈魚骨蛋白水解對(duì)苦味的影響

2.1.1 適度水解不同時(shí)間下水解度以及苦味和澀味的變化 如圖2可知，鱈魚骨水解度在0～180 min增加較快，180～240 min 時(shí)基本趨于穩(wěn)定。如圖3A可知，在120 min 之前，水解度的增加沒(méi)有引起苦味的顯著變化，直到180 min 時(shí)，酶解物中的苦味具有顯著性提高（P<0.05），并且之后苦味也隨著時(shí)間的增加而增加。如圖3所示，對(duì)照組（0 min）與第60 min和第120 min 時(shí)的苦味值無(wú)顯著性差異，苦味值分別為6.1、5.9 和5.8，這可能由于水解時(shí)間過(guò)短，水解不完全導(dǎo)致一些具有苦味特征的短肽沒(méi)有暴露，苦味值沒(méi)有顯著性的變化。同時(shí)，60 min 時(shí)電子舌測(cè)定的澀味值為13.27，120 min 時(shí)澀味值為11.67（圖3B），因此在120 min 時(shí)，酶解液具有很低的苦味強(qiáng)度，并且澀味相比于對(duì)照組（0 min）也有了顯著性的降低，所以在120 min 時(shí)鱈魚骨酶解液具有較好的風(fēng)味特征。綜上所述，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到120 min，水解度達(dá)到7.48%時(shí)，酶解物無(wú)明顯的苦味特征。

圖2 適度水解不同時(shí)間下水解度的變化Fig.2 The change of the degree of hydrolysis under different time of mild hydrolysis

圖3 適度水解不同時(shí)間下苦味強(qiáng)度和澀味強(qiáng)度的變化Fig.3 The change of bitterness intensity and astringency intensity under different time of mild hydrolysis

2.1.2 深度水解不同時(shí)間下水解度以及味道值的變化 通過(guò)堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)鱈魚骨進(jìn)行深度水解，但由于骨類物質(zhì)特殊的剛性結(jié)構(gòu)，水解效率會(huì)受到限制，如豬骨在中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的作用下水解度僅能達(dá)到約14%[12]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩步水解解決了鱈魚骨水解效率低的缺點(diǎn)。如圖4所示，加入混合酶后2 h 水解度趨于平穩(wěn)，在第2～3 h 雖然水解度有顯著性的提升(P<0.05)，但從趨勢(shì)上看，水解度趨于平穩(wěn)，已經(jīng)達(dá)到了平衡的狀態(tài)（一段水解）。將第一段水解的鱈魚骨沉淀高壓蒸煮30 min 后，繼續(xù)加混合酶進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)水解度有較為顯著的增加，直至第6 h 趨于平衡，此時(shí)水解度高達(dá)49.24%（二段水解）。

圖4 深度水解不同時(shí)間下水解度的變化Fig.4 The change of degree of hydrolysis under different time of extensive hydrolysis

如圖5所示，將一段水解與二段水解后的鱈魚骨沉淀進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)一段水解后鱈魚骨表面呈現(xiàn)約100 nm 的長(zhǎng)條紋路，二段水解后鱈魚骨表面呈現(xiàn)約20 nm 的圓形顆粒。這表明高壓蒸煮有效地軟化了鱈魚骨的剛性結(jié)構(gòu)，使混合酶能夠更深入地對(duì)底物進(jìn)行水解，促進(jìn)水解度的增加。同時(shí)測(cè)定鱈魚骨及其一段水解與二段水解后沉淀中的蛋白含量，鱈魚骨原料（干重）中的蛋白質(zhì)含量為59.65%，第一階段水解后，沉淀物中（干重）蛋白質(zhì)的含量減少到14.26%，而二段水解后蛋白質(zhì)含量減少到9.36%，說(shuō)明深度水解的方式可以提高鱈魚骨蛋白質(zhì)的水解效率，從而提高水解度，達(dá)到深度水解的效果。

圖5 一段酶解后（A）與二段酶解后（B）鱈魚骨表面的掃描電鏡圖（150000×）Fig.5 The scanning electron micrograph of cod bone surface after the first (A) and second (B) enzymolysis(150000×)

如表1所示，對(duì)一段水解與二段水解后的上清液進(jìn)行了味道值的電子舌測(cè)定，二段水解后的綜合味道值要優(yōu)于一段水解后，尤其苦味顯著降低（P<0.05），這可能由于長(zhǎng)鏈肽的進(jìn)一步水解使多肽中的疏水性氨基酸殘基水解成游離氨基酸，而游離氨基酸對(duì)苦味無(wú)明顯影響[13?14]，導(dǎo)致苦味的降低。游離氨基酸的產(chǎn)生對(duì)鮮味的變化具有較大的影響，如谷氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸這些呈味氨基酸的增加會(huì)導(dǎo)致鮮味上升[15]。隨著水解度的增加，大量的鹽類物質(zhì)也會(huì)隨之產(chǎn)生，這些物質(zhì)促使著水解物咸味的增加[16]。深度水解后的味道變化有利于其在食品中進(jìn)行應(yīng)用，通過(guò)水解達(dá)到增鮮、減咸、減苦的效果，并且避免了其他物質(zhì)的添加，更有利于健康以及現(xiàn)代食品的加工理念[17]。

表1 兩段式酶解后鱈魚骨酶解上清液電子舌味道值Table 1 The taste value of enzymatic supernatant electronic tongue after the second enzymolysis

2.2 深度水解對(duì)鱈魚骨水解物游離氨基酸的影響

深度水解是通過(guò)游離氨基酸的無(wú)苦特性降低蛋白水解物中的苦味，當(dāng)鱈魚骨水解度達(dá)到49.24%時(shí)，大量的疏水性氨基酸殘基會(huì)轉(zhuǎn)化為游離氨基酸，如表2所示，在一段水解中，丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸這六種疏水性游離氨基酸占總游離氨基酸含量的36.09%，進(jìn)行深度水解后，六種疏水性氨基酸的含量相比于一段水解時(shí)上升幅度分別為39.51%、92.25%、67.45%、48.78%、41.31%、21.43%，并且疏水性游離氨基酸占總游離氨基酸含量的37.09%。這表明多肽中的一些疏水性氨基酸殘基被水解成游離氨基酸，導(dǎo)致酶解液中疏水性多肽的降低，從而抑制了苦味的產(chǎn)生。

表2 兩段式酶解后鱈魚骨酶解上清液游離氨基酸的含量Table 2 The free amino acid content of cod bone hydrolysate supernatant after the second enzymolysis

2.3 適度水解與深度水解的鱈魚骨多肽對(duì)苦味的影響

通過(guò)Nano-LC-Q-TOF-MS/MS 對(duì)多肽分子量的分布進(jìn)行研究，如圖6所示，對(duì)適度水解和深度水解的多肽分子量進(jìn)行排布，發(fā)現(xiàn)無(wú)論適度水解還是深度水解，多肽的分子量主要都在500～3000 Da 的范圍內(nèi)。木瓜蛋白酶進(jìn)行適度水解時(shí)，多肽主要集中在1000～2000 Da 的范圍內(nèi)，并且在1800～1900 Da 的范圍內(nèi)多肽含量最高，大于2000 Da 的多肽數(shù)量較少。在混合酶作用下的深度水解中，多肽數(shù)量主要集中在500～1500 Da 的范圍內(nèi)，并在600～700 Da 的范圍內(nèi)出現(xiàn)了峰值。綜上所述，適度水解后的多肽總體分子量要大于深度水解，并且木瓜蛋白酶的作用位點(diǎn)位于賴氨酸殘基和精氨酸殘基[18?19]，賴氨酸和精氨酸并不是疏水性氨基酸，這會(huì)促使一些疏水性氨基酸殘基位于肽鏈內(nèi)部，并且多肽的卷曲也可能使一些疏水性氨基酸隱藏在肽鏈內(nèi)部，促使苦味降低。在深度水解時(shí)，由于酶切作用點(diǎn)的增加和兩段式水解的技術(shù)手段，深度水解的多肽分布基本上以短肽為主，更導(dǎo)致了疏水性氨基酸殘基轉(zhuǎn)化成游離氨基酸，這是促使深度水解苦味較低的主要因素[5,20]。通過(guò)不同技術(shù)手段進(jìn)行苦味控制，這種簡(jiǎn)便、安全的技術(shù)可以應(yīng)用于食品加工中，適度水解液的多肽分子量較大，具有良好的乳化性和起泡性，可以用于乳液方面的研究[21?22]；深度水解液的多肽分子量較小，游離氨基酸含量較高，擁有較好的活性和鮮味，可以廣泛應(yīng)用于調(diào)味料、保健食品等方面的開(kāi)發(fā)[23]。

圖6 適度水解（A）與深度水解（B）后鱈魚骨酶解液中多肽分子量的分布Fig.6 The molecular weight distribution of cod bone hydrolysates after mild (A) and extensive (B) hydrolysis

由表3、表4可知，將適度水解和深度水解后鱈魚骨酶解物中數(shù)量較多的30 種肽段進(jìn)行研究。總體上，無(wú)論適度水解還是深度水解，多肽主要都來(lái)自膠原蛋白、肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，尤其是膠原蛋白居多，這也間接證明了鱈魚骨中含有大量的膠原蛋白，并且適度水解中多肽的分子量偏大，多肽主要集中在大于1000 Da 的區(qū)域；深度水解多中多肽的分子量偏小，多肽主要集中在1000 Da 以下。

表3 適度水解后鱈魚骨酶解物的多肽序列Table 3 The polypeptide sequence of cod bone hydrolysates after mild hydrolysis

如表3所示，在適度水解中六種疏水性氨基酸（Ala、Val、Met、Leu、Ile、Phe）占氨基酸總量的31.17%，并且氨基酸多數(shù)位于多肽的中間位置。有研究表明疏水性氨基酸位于肽的C-末端或N-末端時(shí)，苦味會(huì)更重[24?25]。在表4中，多數(shù)的多肽氨基酸數(shù)量少于10 個(gè)，六種疏水性氨基酸占總氨基酸的30.13%，在C-末端或N-末端的多肽主要是甘氨酸，由于甘氨酸不屬于疏水性氨基酸，所以產(chǎn)生的苦味值較低。

表4 深度水解后鱈魚骨酶解物的多肽序列Table 4 The polypeptide sequence of cod bone hydrolysates after extensive hydrolysis

3 結(jié)論

本研究以鱈魚骨為原料，通過(guò)蛋白酶水解技術(shù)將鱈魚骨中的蛋白質(zhì)進(jìn)行回收利用，通過(guò)控制水解度的方法控制水解物苦味的產(chǎn)生，并探究水解物中多肽和游離氨基酸對(duì)于苦味的產(chǎn)生機(jī)制。結(jié)果表明，適度水解時(shí)，添加蛋白含量0.3%的木瓜蛋白酶酶解2 h，此時(shí)酶解物的苦味值在水解度達(dá)到平衡前最低；通過(guò)兩段式酶解，添加底物質(zhì)量0.1%的堿性蛋白酶、0.1%的風(fēng)味蛋白酶和0.05%的胰蛋白酶，在高壓蒸煮技術(shù)的輔助下水解6 h 的酶解物無(wú)明顯的苦味特征，通過(guò)控制水解度的方法抑制了酶解過(guò)程中大量苦味的產(chǎn)生，這種低苦的酶解液可以作為天然乳化劑用于各種飲料、調(diào)味品等食品中。但酶解液中苦味肽的種類以及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的探索。