錢慧琴，彭 媛，黃秀秀，于舒雁，劉冰冰，王 寧，趙永恒

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院，河南新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州黃河護理職業(yè)學院，河南鄭州 450066；3.湖北醫(yī)藥學院，湖北十堰 442000）

抑郁癥是一種僅次于心血管疾病的第二大慢性疾病[1]，同時也是全球最常見的致殘原因之一。常見臨床癥狀是以抑郁情緒、興趣喪失、精力減少等為主，嚴重影響人的思想，情緒和身體健康[2]。目前，臨床治療抑郁癥多以西藥為主，盡管它可以起到較好的治療作用，但易出現惡心、嘔吐、口腔潰瘍、焦躁不安等不良反應[3]。中藥對抑郁癥的治療雖起效緩慢，但是卻很少發(fā)生不良反應[4]，因此，從中藥中尋找抗抑郁藥已成為當代藥學研究的一個熱點。

預知子，又名八月札、八月瓜、野香蕉等，為木通科植物木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三葉木通fAkebia trifoliata（Thunb.）Koidz.或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.var.australis（Diels）Rehd.的果實。果實鮮甜可口，維生素C、氨基酸和蛋白含量較高，具有提高免疫力，延緩衰老等保健作用[5?7]，具有較高的食用價值。預知子作為中藥使用，能疏肝理氣，活血止痛，散結，利尿[8]。中醫(yī)臨床認為有疏肝理氣的中藥具有抗抑郁的作用[4]。中醫(yī)臨床實踐發(fā)現預知子及其復方消郁顆粒治療抑郁癥療效較好[9]，且經實驗研究證實，其提取物可通過調控神經可塑性相關蛋白的水平而具有抗抑郁作用[10]。然而其抗抑郁的活性成分及作用機制尚不明確。

網絡藥理學是將多向藥理學和系統(tǒng)生物學整合的一種新的藥物研究方法，從“多成分，多靶點，多通路”的角度全面系統(tǒng)地探討中藥治療疾病的作用機制。因此，本研究利用網絡藥理學揭示預知子抗抑郁的物質作用基礎和作用機制，為抑郁癥藥物的研發(fā)提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），Pubchem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），PharmMapper數據庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），Swiss TargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/），GeneCards 數據庫（ https://www.genecards.org/），STRING 平臺（https://string-db.org/），DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），Cytoscape 3.6.0 軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 預知子活性成分收集與篩選 使用TCMSP數據庫挖掘預知子的化學成分，篩選并保存類藥性（DL）≥0.10，口服生物利用度（OB）≥20%的活性成分[11]，同時將未符合篩選標準，但生物活性較好的成分納入預知子活性成分。使用PubChem 數據庫獲取篩選活性成分的結構的SDF 和SMILES 格式。

1.2.2 預知子抗抑郁靶點收集 將以上獲取的預知子有效成分分子結構（sdf）和Smiles 格式分別導入基于藥效團模型的藥物靶點的PharmMapper 和利用化學相似性預測靶點的Swiss TargetPrediction 數據庫中，預測預知子化合物作用靶點。為了獲取可靠性較高的靶點，只保留PharmMapper 中Norm fit score≥0.9[12]和Swiss TargetPrediction 中Probability≥0.5[13]的藥物靶點。

以“Depression”為關鍵詞從 GeneCards 數據庫收集抑郁相關靶點。采用Omicshare 平臺上的維恩圖工具找出抑郁相關靶點與活性成分對應靶點的共同靶蛋白，即為預知子抗抑郁的作用靶點。

1.2.3 網絡構建 將預知子抗抑郁相關靶點導入String 數據庫中，物種設置為“homo spaiens”，最低相互作用閾值設為0.7，其余參數保持默認值[14]。獲取預知子抗抑郁靶蛋白的互作關系（Protein-protein interactions,PPI）。

使用Cytoscape 3.6.0 軟件構建化合物-靶點和PPI 網絡，網絡拓撲參數度（degree）值、介數（Betweenness Centrality）和接近中心性（Closeness Centrality）可用于評價節(jié)點在網絡中重要性。度值是指一個節(jié)點與多少個節(jié)點直接相連，與其他點連接的個數越多，介數是計算通過某個節(jié)點的最短路徑數，而接近中心性是指一個節(jié)點到其他節(jié)點的所有最短路徑之和的倒數。節(jié)點的度值、介數和接近中心性越大，說明該節(jié)點在網絡中越處于核心位置。一般節(jié)點度值，介數和接近中心性大于其平均值，則可被認為該節(jié)點為網絡中的核心節(jié)點[15]。

1.2.4 信號通路與生物過程分析 將上述預知子抗抑郁關鍵作用靶點的uniprit ID 導入DAVID 6.8 數據庫中，進行京都基因與基因組百科全書（ KEGG）代謝通路和基因本位（ GO） 富集分析。

1.2.5 預知子核心活性成分-靶點分子對接 從Pubchem 數據庫中下載預知子核心活性成分的3D 結構，PDB 數據庫中下載核心靶蛋白的3D 結構。采用AutoDock vina 軟件實施活性成分-靶點分子對接。采用Pymol 軟件將分值最低且具較好構象的分子對接結果可視化。

2 結果與分析

2.1 預知子化合物-靶點網絡

由TCMSP 數據庫檢索并篩選得到23 個活性成分，由于Calceolarioside B[16]和 akebonoic acid[17]的OB 值較低，Ferulic acid[18]的DL 值較低，但是它們都具有較好的生物活性，故考慮將其納入分析，最終得到預知子活性成分26 個（見表1）。針對每個活性成分，通過PharmMapper 和Swiss TargetPrediction數據庫檢索并篩選，共得到118 個化學成分靶點。利用GeneCards 數據庫挖掘到抑郁相關的靶點有8959 個。將118 個預知子有效成分靶點與8959 個抑郁相關靶點進行匹配，共得到95 個預知子抗抑郁靶點（見圖1）。

表1 預知子活性化合物基本信息Table 1 Detailed information of active compounds of Akebiae Fructus

圖1 成分靶點與疾病靶點交集的維恩圖Fig.1 Venn diagram after intersection of component targets and disease targets

預知子化合物-靶點網絡如圖2所示，圖2中圓形代表預知子化合物，三角形代表預知子抗抑郁靶點，共有121 個節(jié)點，500 條邊。由網絡拓撲分析可知，化合物的平均連接度值、介數和接近中心性分別為19.23、0.05 和0.41，說明預知子化合物作用于多個靶點。經由網絡拓撲參數篩選，共有6 個重要活性成分，包括木通苯乙醇B （C1,degree=39）、硬脂酸甘油酯（C25,degree=31）、豆甾醇葡萄糖苷（C11,Degree=29）、齊墩果酸（C2,Degree=28）、西托糖苷（C3,Degree=25）、蝙蝠葛堿（C14,Degree=23），推測以上活性成分為預知子抗抑郁的核心有效成分。

2.2 PPI 網絡

將String 數據庫中獲取的個蛋白互作關系導入Cytoscape3.6.0 軟件中構建PPI 網絡（圖3），圖3中共有76 個節(jié)點和174 條邊，經過網絡拓撲分析可知，8 個靶點的度值、介數和接近中心性大于其平均值（4.58、0.03 和0.42），包括表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶1/8（MAPK1/8）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、熱休克蛋白HSP 90α（HSP90AA1）、雄激素受體（AR）、雌激素受體（ESR1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP3），提示以上靶點是預知子治療抑郁癥的核心靶點。

圖3 PPI 網絡Fig.3 PPI Network

2.3 通路富集分析

為了探究預知子抑郁癥相關靶點的GO 生物功能，通過DAVID 數據庫對8 個預知子抗抑郁關鍵靶點進行基因的功能注釋及通路富集分析。以顯著性P<0.05 為篩選條件，共篩選出9 個生物過程（Biological Process），主要涉及應激反應（response to stress）、ERBB2 信號通路（ERBB2 signaling pathway）、一氧化氮生物合成過程的正調控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）等。4 個細胞組成（Cell Component），包括細胞核（nucleus）、細胞質（cytoplasm）、細胞溶質（cytosol）等。9 個分子功能（Molecular Function），主要涉及一氧化氮合酶調節(jié)活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、酶結合（enzyme binding）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）等。預知子抗抑郁核心靶點的GO 富集分析結果見圖4。

圖4 GO 富集分析結果Fig.4 Results of GO enrichment analysis

由KEGG 通路富集分析結果可知，以通路的顯著性P<0.05 為篩選條件，8 個核心靶點共富集32 條通路。排除疾病信號通路，結合文獻檢索，共得到16 條與抑郁癥相關的通路。通過Omicshare 平臺中的氣泡圖進行可視化，如圖5，圓點越大顏色越深，表明該通路富集的靶點數目越多，P值也越小。排名靠前信號通路的有催乳素信號通路（Prolactin signaling pathway）、ErbB 信號通路（ErbB signaling pathway）、GnRH 信號通路（GnRH signaling pathway）、黏著斑（Focal adhesion）等，表明預知子的活性成分通過調節(jié)多靶點、多通路起到抗抑郁的效應。

圖5 預知子抗抑郁通路的氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of anti-depression pathway of Akebiae Fructus

2.4 分子對接試驗結果

以化合物-靶點網絡中篩選的核心化學成分木通苯乙醇B、硬脂酸甘油酯、豆甾醇葡萄糖苷、齊墩果酸、西托糖苷和蝙蝠葛堿為配體，PPI 網絡中篩選的核心靶點EGFR、MAPK1、MAPK8、SRC、HSP90AA1、AR、ESR1、CASP3 為受體，采用AutoDock vina 軟件實施分子對接。一般認為分子對接的結合能越低，說明配體與受體相互作用越高。據文獻[19]報道，若配體和受體的結合能≤?5.0 kcal·mol?1則被認為有效分子對接。由表2可知，除了硬脂酸甘油酯-ERFG的對接活性較弱外，其他47 對核心活性成分與靶蛋白（97.92%）均有較好的結合活性。其中，8 對核心活性成分與靶點（16.67%）的結合能均小于或等于?9.0 kcal/mol，顯示出較強的結合活性。值的注意的是，蝙蝠葛堿-MAPK1、豆甾醇葡萄糖苷-MAPK1、木通苯乙醇B-MAPK8 和木通苯乙醇B-MAPK1 的對接活性最好，如圖6可知，活性成分能夠比較好地嵌入到靶蛋白的活性口袋中，形成穩(wěn)定的構象。

圖6 結合能最低的分子對接模式Fig.6 Docking mode with lowest binding energies

表2 預知子核心活性成分和核心靶點的結合能Table 2 Binding energies of kenerl compounds and targets of Akebiae Fructus

3 討論與結論

本文采用網絡藥理學和分子對接揭示預知子抗抑郁作用機制。通過構建預知子“化學成分-靶點”網絡，篩選得到6 個核心活性成分，包括木通苯乙醇B、硬脂酸甘油酯、豆甾醇葡萄糖苷、齊墩果酸、西托糖苷和蝙蝠葛堿。腦源性神經營養(yǎng)因子（brain -derived neurotrophic factor,BDNF）參與情緒和認知功能的關鍵腦回路中的神經元的生存、生長和維護。BDNF 的減少直接參與抑郁癥的病理生理過程[20]。齊墩果酸能夠增加海馬BDNF 水平而具有抗抑郁作用[21]。西托糖苷和豆甾醇葡萄糖苷均屬于甾體活性成分，在其四環(huán)核周圍的官能團的作用下，具有廣泛的生物活性。有報道指出豆甾醇葡萄糖苷的苷元在小鼠強迫游泳試驗、尾部懸掛試驗和川芎嗪所致上瞼下垂、體溫過低和運動抑制試驗中通過縮短小鼠靜止時間，增加小鼠運動活性、減少上瞼下垂、拮抗小鼠體溫下降而表現出顯著的抗抑郁作用[22]。西托糖苷的苷元的同分異構體—β-谷甾醇通過增加中樞神經系統(tǒng)中的血清素和去甲腎上腺素水平而具有抗抑郁活性[23]。另外，分子對接結果顯示木通苯乙醇B、豆甾醇葡萄糖苷、齊墩果酸、西托糖苷和蝙蝠葛堿均能較好地嵌合到核心靶蛋白的活性口袋中。

由PPI 網絡篩選出8 個預知子抗抑郁核心靶點，包括EGFR、MAPK1/8、SRC、HSP90AA1、AR、ESR1、CASP3。EGFR 和HSP90AA1 在多種惡性腫瘤中高表達，而重度抑郁癥在腫瘤患者中很常見，是普通人群的患病率的4 倍[24?25]。因此，研究者發(fā)現EGFR 突變型非小細胞肺癌通過介導炎癥因子的產生抑郁情緒[26]，肝癌患者有中度/重度抑郁與HSP90AA1 上調相關[27]。I?iguez 等[28]發(fā)現大鼠強迫游泳實驗中，成年雄性Sprague-Dawley 大鼠海馬中MAPK1 過表達能夠誘導產生抗抑郁樣行為。另外，MAPK8 是成年海馬中神經發(fā)生的中樞抑制因子，同時也是焦慮和抑郁樣行為的啟動因子[29]。AR 可能通過改變miR-204-5p 的表達，調節(jié)BDNF的表達，從而影響慢性輕度應激型小鼠的抑郁樣行為[30]。雌激素可調節(jié)神經遞質的轉換，提高血清素和去甲腎上腺素的水平，進而產生抗抑郁的作用。而雌激素的生物功能在很大程度上是通過細胞內激活其主要受體雌激素受體α（ESR1）和雌激素受體β（ESR2）發(fā)揮的。因此，雌激素受體的遺傳變異在女性患抑郁癥的易感性發(fā)揮著重要作用[31?32]。有研究指出谷氨酸能系統(tǒng)的功能障礙和突觸可塑性的失調與抑郁癥有關[33]。海馬長期抑郁是一種活躍的突觸可塑性，對空間記憶、情境性恐懼記憶和新穎性習得的鞏固具有重要作用，通過線粒體激活caspase-3 是海馬神經元長期抑郁和N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDR）內化所必需的[34]。分子對接顯示以上大部分核心靶點與預知子核心活性成分具有較好的結合活性。

由KEGG 通路富集分析可知，核心靶點主要調控催乳素信號通路、ErbB 信號通路、GnRH 信號通路等信號通路。在催乳素信號通路中，有4 個預知子抗抑郁靶點參與調控。Jak/Stat 通路在催乳素信號轉導中的核心作用。有文獻報道，在慢性輕度應激抑郁癥模型中，通過抑制JAK2-STAT5 信號通路的激活，從而降低催乳素受體（Prolactin receptor，PRLR）表達，抑制海馬神經元凋亡，從而減輕慢性輕度應激誘導的抑郁[35]。抑郁癥發(fā)病機制的單胺假說認為抑郁癥是由大腦中突觸單胺類神經遞質（5-羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺）減少引起的[36]?；A研究表明神經營養(yǎng)因子Neuregulin 1 （NRG1）及其受體ErbB酪氨酸激酶調節(jié)中腦多巴胺（DA）傳遞和腦內多巴胺神經元的mglur1 依賴性長期抑郁[37]。有研究指出下丘腦激素GnRH 刺激垂體的黃體生成素和卵泡生成素的分泌，這兩種激素反過來調節(jié)卵巢和睪丸的功能，而促性腺激素水平的變化會影響情緒，并有助于情感障礙的發(fā)展[38]。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學和分子對接方法初步探究預知子抗抑郁的藥效物質基礎，作用靶點和其調控的抗抑郁通路，發(fā)現預知子通過“多成分，多靶點，多通路”的作用機制而起到抗抑郁的效應，這為后續(xù)預知子抗抑郁的分子作用機制提供了新思路和新方法。