谷 旭，吳雨珊，高云峰，商方方，王 嬌，梁海軍*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全飼料源性因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.北京農(nóng)檢科技有限公司，北京 100193；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品和獸藥飼料技術(shù)鑒定站，黑龍江哈爾濱 150090）

苜蓿有“牧草之王”的稱(chēng)號(hào)，是目前世界種植面積最大、可利用價(jià)值最高、分布最廣的牧草。苜蓿一年可收割4～7 次[1]，粗蛋白質(zhì)含量可達(dá)18%，遠(yuǎn)高于小麥、玉米等其他牧草，在草食家畜養(yǎng)殖中有著不可替代的地位。國(guó)家實(shí)施振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動(dòng)，帶動(dòng)優(yōu)質(zhì)苜蓿種植面積不斷擴(kuò)大，質(zhì)量快速提升，有力促進(jìn)了苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。苜蓿為多年生植物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，為病、蟲(chóng)提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定適宜的環(huán)境，為提高產(chǎn)量使用農(nóng)藥成為去除病蟲(chóng)草害不可避免的手段[2-7]。苜蓿生產(chǎn)中使用的化學(xué)農(nóng)藥有甲萘威、亞胺硫磷、異丙威等，使用最多的是有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥[8]。

殘留在苜蓿中的農(nóng)藥經(jīng)飼喂進(jìn)入動(dòng)物體，輕則影響畜禽生理健康和生產(chǎn)性能，嚴(yán)重可殘留在畜禽產(chǎn)品中，對(duì)人體健康構(gòu)成潛在隱患。雖然對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法研究報(bào)道很多[9-12]，但國(guó)內(nèi)外對(duì)苜蓿中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的研究較少[1]，對(duì)苜蓿中農(nóng)藥殘留情況更是鮮有報(bào)道，因而有必要開(kāi)展苜蓿等飼草中的農(nóng)藥多殘留分析方法研究。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)具有高分離性能、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)國(guó)內(nèi)[13-15]國(guó)外[16-17]許多農(nóng)藥殘留檢測(cè)均用LC-MS/MS 方法。利用LC-MS/MS 進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)是分析領(lǐng)域的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)[18-19]，QuErChERS 有著可應(yīng)用的農(nóng)藥范圍廣、回收率、準(zhǔn)確度、精確度高等優(yōu)點(diǎn)[17,19]。本研究旨在建立一種有機(jī)溶劑提取、QuErChERS 技術(shù)凈化和LC-MS/MS 技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)苜蓿中15 種農(nóng)藥殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甲萘威、仲丁靈、樂(lè)果、甲萘威、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、三唑酮、烯唑醇、甲霜靈、甲基硫菌靈、嘧菌酯、多菌靈、二嗪磷、甲基異柳磷、異丙威15 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品純度均99%。試驗(yàn)所用試劑包括乙腈為色譜純（美國(guó)Sigma Aldrich）、甲酸為色譜純（美國(guó)Dikma Pure）、均質(zhì)子（天津Agela Technologies）、MS-MG5052 QuEChERS 鹽 包（50 mL，內(nèi)含6 g 無(wú)水硫酸鎂和1.5 g 無(wú)水乙酸鈉）和MS-9PP0264購(gòu)自天津Agela Technologies，QuEChERS 凈化管（15 mL，內(nèi)含1 200 mg 無(wú)水硫酸鎂、400 mg PSA、60 mg PC、400 mg C18，MS-9PP0264）購(gòu)自天津Agela Technologies、0.22 μm 尼龍針式過(guò)濾器。試驗(yàn)用水均為超純水，風(fēng)干苜蓿（2018 年5 月23 日播種，同年9 月28 日收割）來(lái)源于黑龍江省。

1.2 儀器與設(shè)備 APΙ 4000+液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)SCΙEX）：配電噴霧離子源（ESΙ）；離心機(jī)（日本Hitachi）；渦旋混勻器（美國(guó)Scilogex）；分析天平（德國(guó)Sartorius）

1.3 溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別取15 種農(nóng)藥（敵草隆、仲丁靈、樂(lè)果、甲萘威、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、三唑酮、烯唑醇、甲霜靈、甲基硫菌靈、嘧菌酯、多菌靈、二嗪磷、甲基異柳磷、異丙威）標(biāo)準(zhǔn)品0.2 mg 于燒杯中，用乙腈溶解，溶解液全部轉(zhuǎn)移至10 mL 的容量瓶中，燒杯用乙腈潤(rùn)洗3 次，潤(rùn)洗液全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用乙腈定容，配制成濃度為20 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

混合標(biāo)準(zhǔn)液配制：上述15 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別準(zhǔn)確移取1 mL 至25 mL 容量瓶中并定容至25 mL，用乙腈稀釋至刻度，配制成濃度為0.8 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 稱(chēng)取2.00 g 經(jīng)粉碎后的苜蓿樣品于50 mL 離心管中（每個(gè)樣品3 個(gè)平行），加入10 mL 水浸泡并平衡2 min，加入10 mL 乙腈和4 顆均質(zhì)子渦旋混勻1 min，在樣品中加入QuEChERS 萃取鹽包（50 mL，內(nèi)含6 g 無(wú)水硫酸鎂和1.5 g 無(wú)水乙酸鈉）劇烈振蕩1 min，然后經(jīng)8 000 r/min 離心10 min，分離提取液。

1.4.2 凈化 將5 mL 提取液轉(zhuǎn)移至15 mL QuEChERS 凈化管，渦旋振蕩1 min，8 000 r/min 離心5 min，取0.5 mL上清液和0.5 mL 水置于1.5 mL 離心管中，渦旋混勻后，過(guò)0.22 μm 濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定和確證。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.5.1 液相色譜條件色譜柱 Kinetex F5，2.6 μm，100 ?，3.0×50 mm；流動(dòng)相：0.1% 甲酸的水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：30℃；液相色譜梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%A-5%B；1.0～3.0 min，60%A-40%B；3.0～4.5 min，15%A-85%B；4.5～6.0 min，5%A-95%B；6.0～12.0 min，95%A-5%B。

1.5.2 質(zhì)譜條件離子源 電噴霧電離子ESΙ（+），電噴霧電壓：5.5 kV，噴霧器壓力：50 Psi；氣簾氣壓力：10 Psi；輔助氣壓力：55 Psi。離子源溫度：500℃；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

1.6 方法驗(yàn)證 在0.25～20 μg/L 內(nèi)配制敵草隆、仲丁靈、馬拉硫磷、樂(lè)果、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、三唑酮、烯唑醇、甲霜靈、甲基硫菌靈、嘧菌酯、多菌靈、二嗪磷、甲基異柳磷、異丙威15 種混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，按本試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，擬合一次線(xiàn)性方程，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得到15 種農(nóng)藥分別對(duì)應(yīng)的一次線(xiàn)性回歸方程。稱(chēng)取2.0 g 空白基質(zhì)樣品，采用基質(zhì)加標(biāo)的方法添加15 種農(nóng)藥，按照本試驗(yàn)的處理方法與條件進(jìn)行檢測(cè)，以3 倍基線(xiàn)噪聲（S/Ν=3）計(jì)算方法檢出限，以10 倍基線(xiàn)噪聲（S/Ν=10）計(jì)算方法定量限。

采用基質(zhì)加標(biāo)方式，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以2.5、5、20、50、100、200 μg/kg 共6 個(gè)梯度分別加入各標(biāo)準(zhǔn)藥品，每梯度做 3 個(gè)重復(fù)，按照“1.4”進(jìn)行前處理，按照“1.5”進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.7 基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定 由于苜蓿樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，會(huì)對(duì)分析化合物的離子化程度產(chǎn)生很大影響，因此，本研究考察了苜?；|(zhì)中分析化合物的基質(zhì)效應(yīng)，采用提取后添加法，添加水平為0.02 μg/mL，即基質(zhì)加標(biāo)。

參照“1.4”方法進(jìn)行樣品前處理，制得空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)樣作為基質(zhì)標(biāo)樣，該濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液作為溶劑標(biāo)樣。按“1.5”色譜條件和工作方法進(jìn)行分析測(cè)定，記錄各種農(nóng)藥的峰面積，按基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式進(jìn)行評(píng)價(jià)（如公式（1）所示）。若A/B＞1，則表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；若A/B＜1，則表示基質(zhì)抑制效應(yīng)；若A/B=1，則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)A/B為0.8～1.2 時(shí)，基質(zhì)干擾程度較低；當(dāng)0.5 ＜A/B＜0.8 或 1.2 ＜A/B＜1.5 時(shí)，表現(xiàn)為中等程度的基質(zhì)干擾效應(yīng)；當(dāng)A/B＜0.5 或A/B＞1.5，表示基質(zhì)效應(yīng)的干擾強(qiáng)烈。

式中，Mi為基質(zhì)效應(yīng)；A 為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；B 為純標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件選擇 將藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動(dòng)注射的方式進(jìn)樣，通過(guò)全掃描的方式確定其母離子。在對(duì)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到碎片離子的二級(jí)質(zhì)譜圖。針對(duì)不同目標(biāo)化合物以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)其二級(jí)質(zhì)譜的源內(nèi)裂解電壓、碰撞能量、離子駐留時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使每種化合物的分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。選取豐度較高且較為穩(wěn)定的2 對(duì)特征碎片離子作為定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1 15 種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件選擇 在苜蓿樣品中分別加入15 種農(nóng)藥，通過(guò)“1.4”的方法進(jìn)行前處理，再在“1.5”條件下進(jìn)行檢測(cè)，15 種農(nóng)藥的保留時(shí)間分別是敵草隆4.18 min、仲丁靈5.3 min、樂(lè)果3.6min、甲萘威4.1 min、亞胺硫磷4.5 min、氧化萎銹靈3.8 min、三唑酮4.5 min、烯唑醇4.6 min、甲霜靈4.1min、甲基硫菌靈3.9 min、嘧菌酯4.5 min、多菌靈3.0 min、二嗪磷4.7 min、甲基異柳磷4.9 min、異丙威4.2 min。選擇離子流圖如圖1。

圖1 苜蓿中15 種農(nóng)藥MRM 色譜圖

2.3 線(xiàn)性范圍、檢出限與定量限 在0.25～20 μg/L 采用基質(zhì)加標(biāo)的方法添加15 種農(nóng)藥，以3 倍基線(xiàn)噪聲（S/Ν=3）計(jì)算方法檢出限，以10 倍基線(xiàn)噪聲（S/Ν=10）計(jì)算方法定量限。由表2 可知，15 種農(nóng)藥在0.25～～20 μg/L 線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.997～0.999 9，檢出限（LOD）為0.01～0.5 μg/L，定量限為0.02～1.5 μg/L，符合多種農(nóng)藥殘留分析要求。

2.4 回收率及精密度 由表3 可知，當(dāng)加標(biāo)量為2.5 μg/kg時(shí)，除敵草隆、甲萘威、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、甲基硫菌靈、異丙威和甲硫威外，其他目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率為85.5%～118.5%；RDS 除敵草隆、仲丁靈、甲萘威、氧化萎銹靈、甲基硫菌靈、多菌靈外，其他目標(biāo)化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.4%～19.3%。當(dāng)加標(biāo)量為5 μg/kg時(shí)，除甲基硫菌靈和多菌靈外，其余目標(biāo)物的回收率在76.7%～100.7%；精密度除敵草隆和多菌靈外，其他目標(biāo)物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～18.6%。當(dāng)加標(biāo)量為20 μg/kg時(shí)，15 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在86.7%～117.3%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～18.5%。當(dāng)加標(biāo)量為50 μg/kg 時(shí)，15 種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率為85.4%～107.6%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.6%～14.0%。當(dāng)加標(biāo)量為100 μg/kg 時(shí)，15 種目標(biāo)物的回收率在83.4%～110.4%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 為2.4%～9.9%。當(dāng)加標(biāo)量為200 μg/kg 時(shí)，15 種目標(biāo)物的回收率在83.6%～112.9%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～13.6%。本試驗(yàn)方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留分析方法要求。

表3 15 種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率結(jié)果和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）

2.5 方法的基質(zhì)效應(yīng) 由表4 可知，15 種農(nóng)藥中有14種的基質(zhì)效應(yīng)為30.9%～91.3%，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；只有多菌靈的基質(zhì)效應(yīng)為126.0%，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)。其中，仲丁靈、烯唑醇和甲霜靈受基質(zhì)抑制干擾較低；敵草隆、樂(lè)果、三唑酮和嘧菌酯表現(xiàn)為中等程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，多菌靈為中等程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；甲萘威、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、甲基硫菌靈、二嗪磷、甲基異柳磷和異丙威均表現(xiàn)為強(qiáng)烈的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

表4 15 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng) %

3 結(jié)論

綜上，利用QuErChERS 前處理技術(shù)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的分析方法進(jìn)行苜蓿中15 種農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)。該方法靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、有機(jī)溶劑消耗量少。馬建華等[13]對(duì)苜蓿進(jìn)行五種農(nóng)藥的的殘留分析，相關(guān)系數(shù)0.899 5～0.994 1。本研究中，15 種目標(biāo)物在0.25～20 μg/L，線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.997～0.999 9，檢出限濃度在0.01～0.5 μg/L，定量限在0.02～1.5 μg/L，符合多種農(nóng)藥殘留分析要求。張亞男等[20]利用氣相色譜法測(cè)定韭菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留平均回收率在78.5～106.7%，在加標(biāo)量為50 以上時(shí)，本方法的平均回收率為83.4～117.3%?；厥章屎拖鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿(mǎn)足農(nóng)藥多殘留分析檢測(cè)要求。另外，對(duì)苜蓿樣品檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行分析，檢測(cè)的15 種農(nóng)藥中12種農(nóng)藥受基質(zhì)效應(yīng)影響較大，其中4 種農(nóng)藥表現(xiàn)為中等程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，1 種農(nóng)藥表現(xiàn)為中等程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)干擾，其余的7 種農(nóng)藥表現(xiàn)為強(qiáng)烈的基質(zhì)抑制效應(yīng)。本次試驗(yàn)利用基質(zhì)空白匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析，有效消除了基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的影響，滿(mǎn)足苜蓿中農(nóng)藥殘留分析的要求。因此，在苜蓿樣品檢測(cè)過(guò)程中需利用基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的方法來(lái)消除或補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。本方法給我國(guó)苜蓿農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、進(jìn)出口檢測(cè)等工作提供了一種準(zhǔn)確的定量分析手段。