郭 華 陳月華 宋慧鵬 張 慧

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116000

糖尿病是目前臨床無法完全治愈的慢性高血糖疾病，由胰島素分泌不足和胰島素拮抗或兩者共同引起[1]。糖尿病大多是因遺傳或生活習(xí)慣不良導(dǎo)致的，其引起的并發(fā)癥對人體器官影響范圍較大，屬于高發(fā)病率和高致死率的疾病之一[2]。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計，如今全球糖尿病患者的數(shù)量已超過4億，而且發(fā)病群體逐漸趨于低齡化，這將對整個社會的發(fā)展造成一定的影響[3]。目前，臨床上治療糖尿病的藥物有雙胍類和格列奈類等，而作用靶點單一、耐藥性和副作用等一直是難以規(guī)避的問題[4]。因此，尋找安全、低毒、高效的藥物是目前藥學(xué)研究的主要任務(wù)。

枳實是蕓香科柑橘屬藥材，屬于理氣藥?，F(xiàn)代研究表明枳實含有黃酮類、萜類和揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分[5]。藥理學(xué)研究表明其具有抗腫瘤、抗氧化、促進脂質(zhì)代謝和降血糖等多種藥理作用[6]。如今枳實在中醫(yī)臨床上用以治療糖尿病及其并發(fā)癥的方藥中較為常見，但其藥效成分、作用機制尚未見報道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來新興起的用以研究藥物與疾病關(guān)聯(lián)的方法，其是在大數(shù)據(jù)背景下通過綜合多學(xué)科建立藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，系統(tǒng)地研究藥物對疾病的干預(yù)和影響，更直觀地體現(xiàn)中藥材多成分-多靶點-多通路的作用特點，被廣泛應(yīng)用于中藥研究領(lǐng)域[7]。夏珊等[8]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究了益智仁治療阿爾茲海默癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制，發(fā)現(xiàn)益智仁中白楊素、原兒茶酸、圓柚酮等可能通過抗炎、促進細胞增殖分化等方面治療阿爾茲海默癥。賈成軍等[9]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對崗松揮發(fā)油的藥效組分、藥理作用及其作用機制進行了研究。

1 材料和方法

1.1 枳實中活性成分篩選及其作用靶點收集

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）數(shù)據(jù)庫收載了藥材、化學(xué)成分、藥代動力學(xué)參數(shù)和作用靶點等數(shù)據(jù)，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)支持。通過檢索枳實，獲得所有的化學(xué)成分，以“口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥ 20% 和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18”為標準初步篩選出可能的活性成分。收集活性成分的作用靶點，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）進行基因注釋并剔除重復(fù)、非人源靶點，將靶點名稱轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因名稱。

1.2 疾病靶點的收集及其與藥物靶點取交集

分別在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索“diabetes”，獲得疾病相關(guān)靶基因。整合兩個數(shù)據(jù)庫獲得的基因，去除重復(fù)項，作為疾病靶基因。取藥物靶基因和疾病靶基因的交集部分作為枳實治療糖尿病的潛在作用靶點進行深入研究。

1.3 枳實-活性成分-靶點-糖尿病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

去除與糖尿病靶基因無關(guān)聯(lián)的化學(xué)成分，將枳實活性成分及其與糖尿病交集靶點等數(shù)據(jù)上傳至Cytoscape軟件，構(gòu)建枳實-活性成分-靶點-糖尿病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 枳實與糖尿病交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫綜合了大量的實驗數(shù)據(jù)和文獻資料，被廣泛用于研究蛋白之間相互作用。將枳實-糖尿病交集靶點數(shù)據(jù)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，研究物種選擇“Homo sapiens”，其他條件默認，進行分析。

1.5 基因本體和京都基因與基因組百科全書富集分析

利用R語言在Bioconductor平臺對枳實與糖尿病的交集靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集（P≤ 0.05）分析，并將結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 枳實中的活性成分及其對應(yīng)靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索枳實，共獲得65個化學(xué)成分，限定OB和DL的值后共篩選出30個活性成分，見表1。通過蛋白數(shù)據(jù)庫將化合物靶點與人類基因匹配后，共得到133個相關(guān)靶點。

表1 枳實的活性成分信息

2.2 糖尿病疾病靶點收集及其與活性成分靶點交集可視化

以“diabetes” 為 檢 索 詞 在 GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索。從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索得到13784個基因，以“相關(guān)性得分＞5”作為篩選條件，最終獲得1748個基因。從OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索獲得2577個基因。整合檢索結(jié)果，去除重復(fù)項，共獲得疾病靶基因3305個。將活性成分靶基因和疾病靶基因兩者取交集，交集部分則為枳實與糖尿病關(guān)聯(lián)的靶基因，即枳實治療糖尿病可能的作用靶點。枳實中活性成分與糖尿病交集靶點共有95個，見圖1。

圖1 枳實中活性成分與糖尿病靶點的韋恩圖

2.3 “枳實-活性成分-作用靶點-糖尿病”宏觀網(wǎng)絡(luò)圖

整個網(wǎng)絡(luò)圖共有119個節(jié)點，包括1個藥材節(jié)點（矩形圖標），1個疾病節(jié)點（V形圖標），22個活性成分節(jié)點（菱形圖標）和95個靶基因節(jié)點（橢圓形圖標），見圖2。該體系共包含356條邊，每條邊代表兩節(jié)點之間的相互關(guān)聯(lián)。其中化合物 21（芹菜素）、19（木犀草素）、17（川陳皮素）和14（柚皮素）與靶基因節(jié)點之間的連線較多，提示這4個化合物可能是枳實治療糖尿病的主要成分。

圖2 枳實-活性成分-糖尿病-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 枳實-糖尿病交集靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

95個交集靶點之間共生成1435條蛋白相互作用連線，見圖3。不同的線條表示不同的互作類型，平均節(jié)點度值為30.2。篩選連線較多的前30個基因進行分析，見圖4。提示INS、AKT1、IL6、MAPK3、JUN、MAPK1、VEGFA、CASP3、MAPK8和PTGS2等可能是枳實治療糖尿病的核心靶點。

圖3 枳實與糖尿病交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 枳實與糖尿病交集靶點中前30個核心基因（橫坐標：蛋白互作連線的數(shù)目）

2.5 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

枳實與糖尿病交集靶點的GO功能注釋結(jié)果顯示與104個分子功能相關(guān)（P＜0.05），就前20條進行分析。交集靶點涉及的分子功能按照P值由小到大、自上而下排列，見圖5。P值越小，該功能顯著性越高。交集靶點主要影響RNA聚合酶II-特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合和類泛素蛋白連接酶結(jié)合等。KEGG通路富集結(jié)果共映射出162條通路（P＜0.05），就前20條通路進行分析，見圖6。橫坐標表示該通路富集靶點的個數(shù)，不同通路按照P值由小到大，自上而下排列，P值越小，表示該條通路顯著性越高。結(jié)果顯示這些交集靶點可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、白細胞介素-17（interleuk-17，IL-17）信號通路、FOXO信號通路和AGE-RAGE介導(dǎo)的信號通路等發(fā)揮糖尿病治療作用。值得注意的是，枳實可能對前列腺癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、結(jié)直腸癌和乙型肝炎等抗癌通路具有調(diào)控作用。

圖5 枳實與糖尿病交集靶點的GO分子功能分析（橫坐標：基因富集的數(shù)目）

圖6 枳實與糖尿病交集靶點KEGG富集分析（橫坐標：基因富集的數(shù)目）

3 討論

體內(nèi)外活性實驗耗時較長，不可控因素較多，獲取結(jié)果的過程較為緩慢，在一定程度上阻礙了藥物發(fā)現(xiàn)的進程。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)是近年來新興的藥物研究手段，通過融合多學(xué)科，多數(shù)據(jù)庫進而形成的新型生物網(wǎng)絡(luò)研究模式。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體的角度分析藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)，可以作為活性實驗的導(dǎo)向，是尋找中藥材中活性化合物的重要輔助手段。

中醫(yī)臨床治病用藥有辨證論治，君臣佐使之說。枳實在臨床上用于治療糖尿病及并發(fā)癥的方劑中較為常見，該研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討了枳實治療糖尿病的作用機制。通過限定化合物的OB和DL值并且取與糖尿病靶點具有相關(guān)性的化合物作為研究對象，結(jié)果表明枳實中含有22個成分具有潛在的治療糖尿病作用，其可能的作用靶點有95個。其中，芹菜素通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激，保護胰島β細胞功能，減弱胰島素抵抗，從而產(chǎn)生治療糖尿病作用[10-11]。柚皮素不僅對胰島β細胞功能具有保護作用，還可以增強胰島素敏感性[12]。川陳皮素可以改善糖代謝，進而調(diào)節(jié)血糖平衡[13]。木犀草素可能通過抑制胰腺TLR4、JNKmRNA和蛋白表達水平，從而改善胰島素抵抗，減輕胰腺炎癥反應(yīng)[14]。枳實與糖尿病交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析，提示 INS、AKT1、IL6、MAPK3、JUN、MAPK1、VEGFA、CASP3、MAPK8和 PTGS2可能是枳實發(fā)揮治療糖尿病作用的關(guān)鍵靶點。其中，INS可參與調(diào)節(jié)胰島素分泌，其基因突變會引起高胰島素血癥、高前胰島素血癥和新生兒糖尿病[15]。AKT1可參與調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝，進而維持血糖平衡，該基因的表達與胰島素敏感性有關(guān)[16]。IL-6可改善糖代謝，參與炎癥、胰島素抵抗和β細胞功能障礙等反應(yīng)[17]。MAPK3，MAPK1和MAPK8屬于一類細胞因子，可參與炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗[18]。調(diào)控VEGFA在腎小球中表達可以保護腎小球微血管系統(tǒng)，減少糖尿病對腎臟造成的損傷[19]。CASP3與細胞凋亡有關(guān)，抑制該蛋白的表達可以減少心肌或腎臟等細胞損傷[20]。PTGS2可以產(chǎn)生前列腺素，進而負向調(diào)節(jié)葡萄糖刺激和胰島素分泌，也可以作為炎癥反應(yīng)的中介，從而改善胰島素敏感性[21]。

GO結(jié)果分析顯示，枳實與糖尿病交集靶點的分子功能主要涉及RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合和類泛素蛋白連接酶結(jié)合等。KEGG結(jié)果分析顯示，PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、IL-17信號通路、FOXO信號通路和AGE-RAGE介導(dǎo)信號通路等可能是枳實治療糖尿病的關(guān)鍵通路。PI3K-Akt信號通路是胰島素發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝和脂質(zhì)平衡作用的重要通路[10，22-23]。HIF-1信號通路在介導(dǎo)腎損傷中發(fā)揮重要作用，其機制可能是通過上調(diào)HO-1水平來調(diào)控線粒體動力學(xué)[24-25]。IL-17可引起胰島素抵抗或破環(huán)胰島β細胞[26]。FOXO通路可加速脂肪代謝，保護胰島細胞，同時可以改善炎癥反應(yīng)、細胞凋亡和氧化應(yīng)激等[27]。AGE-RAGE通路可調(diào)控 NF-κB、VGEF、TGF-β1、MCP-1等基因表達，從而減少氧化應(yīng)激損傷[28]。以上結(jié)果提示枳實從多成分、多靶點和多通路發(fā)揮治療糖尿病作用。

多成分、多靶點和多通路是中藥獨有的作用特點，這使得它在人類預(yù)防和治療疾病過程中發(fā)揮了重要作用。中藥是發(fā)掘安全、低毒和高效天然藥物的重要來源，其規(guī)避了作用靶點單一的缺點，多成分從整體上協(xié)同發(fā)揮療效，是近年來學(xué)術(shù)界的研究熱點。該研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討了枳實治療糖尿病的活性成分及其作用靶點與通路，結(jié)果表明枳實對糖尿病的關(guān)鍵靶點和通路具有調(diào)控作用，這將為后期枳實治療糖尿病的活性成分開發(fā)及藥理機制研究提供參考。目前該研究僅在大數(shù)據(jù)背景下探索了枳實治療糖尿病可能的活性成分及其作用機理，后期仍需開展體內(nèi)外活性實驗對結(jié)果的可靠性加以驗證。