陳 欣，鄧彩萍，牛雅琪，王升級(jí)，賈舉慶

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801)

棗(Zizyphusjujuba)，為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZizyphusMill.)植物，是中國(guó)特有經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。但近年來(lái)在山西晉中紅棗產(chǎn)區(qū)(主栽品種為‘壺瓶棗’)發(fā)生的棗黑頂病，導(dǎo)致棗果近成熟期頂部發(fā)黑，果味苦澀，難以食用。該病害在棗果近成熟期發(fā)病嚴(yán)重，極大地降低了棗果的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在一定程度上制約了棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。

前期試驗(yàn)通過(guò)對(duì)發(fā)病區(qū)棗果、棗葉、大氣氟含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)棗黑頂病的發(fā)病率與大氣氟濃度、棗果、棗葉氟含量之間均密切相關(guān)。初步認(rèn)為：氟污染是誘發(fā)病害發(fā)生的一個(gè)誘因[1]。進(jìn)一步研究表明，噴施鈣劑提高了棗果內(nèi)SOD、POD、CAT酶活性，有效減緩棗黑頂病的發(fā)生，推測(cè)該病害的發(fā)生可能與鈣離子濃度減少有一定關(guān)系[2]。通過(guò)細(xì)胞化學(xué)定位觀察棗黑頂病果實(shí)中鈣離子時(shí)發(fā)現(xiàn)，健康棗果皮細(xì)胞中含有較多的Ca2+沉淀顆粒且沿細(xì)胞壁均勻分布，果肉細(xì)胞中也有少數(shù)Ca2+沉淀顆粒；而發(fā)病棗果果肉細(xì)胞器逐漸被降解，棗果實(shí)很難觀察到Ca2+沉淀顆粒[3]。近年來(lái)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法研究果樹(shù)病害的致病機(jī)理廣為報(bào)道，如余賢美等[4]發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因(CDPK26、WRKY26、ADP/ATPcarrier、TUBA、CTSF、RGA4)可以作為蘋(píng)果苦痘病防治的關(guān)鍵基因；張舒怡等[5]、李玲等[6]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)則發(fā)現(xiàn)MYB、C2H2可作為今后研究棗瘋病發(fā)生的分子機(jī)理的關(guān)鍵基因。棗樹(shù)基因組測(cè)序的完成為系統(tǒng)、深入地挖掘棗樹(shù)功能基因，揭示優(yōu)良性狀的分子機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)條件。本研究基于前期的試驗(yàn)研究，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)發(fā)病棗果、噴施氫氧化鈣溶液的棗果以及健康棗果進(jìn)行棗果組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，初探棗果黑頂病可能的發(fā)病機(jī)理，為進(jìn)一步防治該病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地來(lái)源

試驗(yàn)所需的壺瓶棗果采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)棗品種資源圃。研究材料為‘壺瓶棗’，樹(shù)齡10 a左右，結(jié)實(shí)量適中。

1.2 試驗(yàn)方法

于2017年7月15日棗黑頂病易發(fā)病期，對(duì)同一棗樹(shù)出現(xiàn)黑頂病癥狀棗果噴施氫氧化鈣溶液，質(zhì)量濃度為0.011 g/L[2]，噴施頻率為 2 d/次，時(shí)間為6:00，處理20 d后采集形態(tài)近似棗果3顆(ZJPRE)。同時(shí)分別采集自然發(fā)病棗果(ZJINF)及健康棗果(ZJCON)3顆作為對(duì)照組。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。共采集樣品27個(gè)，送至北京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

測(cè)序得到大量的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)，去除Raw Data中的接頭序列、引物序列及低質(zhì)量Reads，得到clean reads。根據(jù)堿基質(zhì)量值Q30、GC含量來(lái)判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量。采用DESeq軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析(padj <0.05)，篩選得到差異表達(dá)基因(DEG)，將獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能(GO)分析和代謝通路(KEGG)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Q30>92.5%，遠(yuǎn)大于85%，與參考基因組(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_001835785.1#/st)的比對(duì)效率為73.65%～ 75.18%，可以滿足后續(xù)的分析要求。

2.2 差異表達(dá)基因分析

差異表達(dá)基因分析表明，自然發(fā)病棗果與健康棗果(ZJINF vs ZJCON)中，有差異表達(dá)基因 13 898個(gè)，其中7 146個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，6 752個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；氫氧化鈣處理?xiàng)椆c健康棗果(ZJPRE vs ZJCON)中，有差異表達(dá)基因5 477個(gè)，其中2 990個(gè)上調(diào)表達(dá)，2 487個(gè)下調(diào)表達(dá)(圖1)。

2.3 差異表達(dá)基因GO分析

本試驗(yàn)中，將所有基因映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)，共有24 946個(gè)基因匹配到信息。在ZJINFvsZJCON中，有10 805個(gè)基因差異表達(dá)，上調(diào)有 5 687個(gè)，下調(diào)有5 118個(gè)。富集的GO條目主要?dú)w納于85個(gè)生物學(xué)過(guò)程、37個(gè)細(xì)胞組分、31個(gè)分子功能。富集程度較高的前20位如表1所示。其中，在生物學(xué)過(guò)程中以細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)(cellular homeostasis)、細(xì)胞氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)(cell redox homeostasis)、谷氨酰胺族氨基酸代謝過(guò)程(glutamine family amino acid metabolic process)、離子跨膜運(yùn)輸(ion transmembrane transport)、金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)(metal ionhomeostasis)、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)(cellular calcium ion homeostasis)為主(表1)，在細(xì)胞組分中以細(xì)胞(cell)、細(xì)胞部分(cell part)、細(xì)胞組分(cellular component)、細(xì)胞膜(membrane)為主，在分子功能中以泛素蛋白連接酶活性(ubiquitin protein ligase activity)、類泛素蛋白連接酶活性(ubiquitin-like protein ligase activity)、鋅離子結(jié)合(zinc ion binding)、鈣依賴磷脂結(jié)合(calcium-dependent phospholipid binding)、鈣離子結(jié)合(calcium ion binding)為主(表1)。

表1 ZJINF vs ZJCON差異基因GO富集結(jié)果Table 1 GO enrichment of DEGs in ZJINF vs ZJCON

在ZJPRE vs ZJCON中，有4 362個(gè)差異表達(dá)基因，其中2 400個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1 962個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。富集的GO條目主要包含52個(gè)生物學(xué)過(guò)程、22個(gè)細(xì)胞組分、11個(gè)分子功能。富集程度較高的20個(gè)基因如表2所示。其中，在生物學(xué)過(guò)程中以防御反應(yīng)(defense response)、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)(cellular homeostasis)、生物刺激反應(yīng)(response to biotic stimulus)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)為主，在細(xì)胞組分中以細(xì)胞(cell)、細(xì)胞器(organelle)、核糖體(ribosome)為主，在分子功能上以氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、核糖體結(jié)構(gòu)組成(structural constituent of ribosome)為主(表2)。

表2 ZJPRE vs ZJCON差異基因GO富集結(jié)果Table 2 GO function of DEGs in ZJPRE vs ZJCON

2.4 差異表達(dá)基因KEGG代謝途徑分析

在ZJINF vs ZJCON中，差異表達(dá)基因共涉及了127條代謝通路，其中氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、碳代謝(carbon metabolism)、吞噬體(phagosome)、植物-病原體互作(plant-pathogen interaction)4條代謝通路上富集的基因數(shù)目居多。在ZJPRE vs ZJCON中，差異表達(dá)基因共涉及126條代謝通路，其中碳代謝、氨基酸的生物合成、核蛋白體(ribosome)這3條代謝通路上富集的基因數(shù)目居多(表3)。植物-病原體互作、吞噬體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)加工這3條代謝通路的富集程度較高。

表3 各對(duì)比中與病害相關(guān)的代謝通路信息Table 3 Pathway information related to disease in each group

2.4.1 棗果植物-病原體互作代謝通路 植物-病原體互作代謝通路中涉及到很多與發(fā)病相關(guān)的重要信息。代謝通路進(jìn)一步分析結(jié)果表明：在ZJINF vs ZJCON中，該代謝通路涉及101個(gè)DEGs，其中74個(gè)DEGs上調(diào)，27個(gè)DEGs下調(diào)。其中CNGCs(環(huán)核苷酸門控離子通道)處有7個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)，2個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)；CDPK(鈣依賴蛋白激酶)處涉及9個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)，2個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)。在ZJPRE vs ZJCON中，該代謝通路涉及了41個(gè)DEGs，其中28個(gè)DEGs上調(diào)，13個(gè)DEGs下調(diào)。其中CNGCs處有4個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)；CDPK處涉及4個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)。

2.4.2 棗果吞噬體代謝通路 在棗果吞噬體代謝通路中，涉及到2種與鈣相關(guān)的蛋白存在差異表達(dá)。代謝通路圖進(jìn)一步分析結(jié)果表明：在ZJINF vs ZJCON中，總共有67個(gè)DEGs，其中上調(diào)48個(gè)，下調(diào)19個(gè)。在CALR(calreticulin，鈣網(wǎng)蛋白)處有2個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)，1個(gè)DEG下調(diào)表達(dá)；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶calnexin處有1個(gè)DEG上調(diào)表達(dá)。在ZJPRE vs ZJCON中，總共有28個(gè)DEGs，其中上調(diào)16個(gè)，下調(diào)12個(gè)。CALR表達(dá)正常；在calnexin處有1個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)。

2.4.3 棗果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工代謝通路 噴鈣處理之后，CNX(鈣聯(lián)蛋白)、CRT(鈣網(wǎng)蛋白)這2個(gè)蛋白趨于正常表達(dá)，且歸屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工代謝通路。在ZJINF vs ZJCON中，該代謝通路總共有154個(gè)DEGs，其中上調(diào)有124個(gè)，下調(diào)有30個(gè)。其中CNX處有1個(gè)DEG上調(diào)表達(dá)；CRT處有2個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)，1個(gè)DEG下調(diào)表達(dá)。在ZJPRE vs ZJCON中，該代謝通路涉及到86個(gè)DEGs，47個(gè)上調(diào)表達(dá)，39個(gè)下調(diào)表達(dá)。其中CNX處有1個(gè)DEG下調(diào)表達(dá)，CRT表達(dá) 正常。

3 討 論

棗果黑頂病嚴(yán)重降低了棗果的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，制約了山西紅棗區(qū)棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，但其發(fā)病機(jī)理仍不明確。前期研究發(fā)現(xiàn)，在棗黑頂病發(fā)病較嚴(yán)重的棗園，噴施氫氧化鈣溶液，棗黑頂病的發(fā)病率和發(fā)病程度均有所減緩，發(fā)病率由71%降為 40.6%，病情指數(shù)由4.1降為2.6[7]。Ca2+在植物體內(nèi)運(yùn)輸，很難運(yùn)送至果實(shí)部位；因此，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化會(huì)直接影響植物生長(zhǎng)發(fā)育以及果實(shí)品質(zhì)[8]。研究表明，CaCl2處理對(duì)菠蘿黑腐病[9]、芒果軟鼻病[10]、蘋(píng)果苦痘病[11]的防控均有一定的效果。鈣對(duì)果實(shí)衰老與生理病害的發(fā)生有一定的抑制作用，其重要原因在于鈣既是膜的穩(wěn)定劑，可以維持和保護(hù)質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)；鈣又可以作為細(xì)胞的第二信使，調(diào)控許多種重要的生理生化防御反應(yīng)，維持細(xì)胞的正常生理功能[8]。在黃瓜[12]、番茄[13]中均發(fā)現(xiàn)外源Ca2+可以促進(jìn)抗氧化酶活性的協(xié)調(diào)變化，提高細(xì)胞中膜的選擇性吸收能力；直接調(diào)節(jié)植物抗病基因的表達(dá)[14-15],增加植物對(duì)病蟲(chóng)害的抗性。本試驗(yàn)中ZJINF與ZJCON對(duì)比發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因功能體現(xiàn)在泛素蛋白連接酶活性、類泛素蛋白連接酶活性、生物刺激反應(yīng)、防御反應(yīng)、鈣離子穩(wěn)態(tài)、鈣依賴磷脂結(jié)合、鈣離子結(jié)合上；而ZJPRE與ZJCON對(duì)比發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因功能體現(xiàn)在防御反應(yīng)、生物刺激反應(yīng)上，與鈣相關(guān)的功能未被富集。可能是外源噴施氫氧化鈣之后，棗果發(fā)病部位鈣離子濃度升高，從而提高了棗果對(duì)黑頂病的抗性[2-3,7]，因此棗果外觀正常，未呈現(xiàn)發(fā)病狀態(tài)。

植物-病原互作因子在植物病害發(fā)生及其對(duì)生物或非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。余賢美等[4]研究蘋(píng)果苦痘病發(fā)現(xiàn)，植物-病原體互作這條通路上富集到了與發(fā)病相關(guān)的蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，ZJINF vs ZJCON差異表達(dá)基因的KEGG富集在植物-病原體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)加工、吞噬體3條代謝通路上，且富集程度較高。噴施氫氧化鈣處理之后，這3條代謝通路涉及的差異表達(dá)基因數(shù)目也明顯下降。這3條代謝通路上，CNGCs、CDPK、CNX、CRT、CALR、calnexin這些蛋白與植物抗病性有關(guān)。CNGCs對(duì)鈣離子有很強(qiáng)的非選擇性，主要參與植物對(duì)特異刺激的免疫反應(yīng)，并發(fā)揮防御反應(yīng)、植物發(fā)育和離子平衡等生物學(xué)功能[16-17]；CDPK是一類植物鈣離子傳感蛋白，在轉(zhuǎn)錄、代謝、運(yùn)輸及其對(duì)生物和非生物脅迫等過(guò)程中發(fā)揮著極為重要的作用[18-19]。CALR及calnexin兩種鈣結(jié)合分子伴侶同樣在植物應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的抗逆方面具有突出作用；在煙草[20]和擬南芥[21]中，CNX和CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的重要的分子伴侶，兩者是同源蛋白，同時(shí)具有高度保守性，在結(jié)構(gòu)、功能上具有很大的相似性，參與維持植物體內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡，還參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆過(guò)程[22]。CNX、CRT還參與蛋白質(zhì)的加工折疊，可能影響農(nóng)作物的產(chǎn)量及品質(zhì)[22]。本試驗(yàn)中，噴施氫氧化鈣處理之后棗果的CALR、CRT兩種鈣蛋白表達(dá)水平均與健康棗果無(wú)顯著差異，棗果外觀接近于正常棗果，進(jìn)一步說(shuō)明噴鈣提高了棗果抗病性，對(duì)病害具有一定的防治效果。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)自然發(fā)病組(ZJINF)、氫氧化鈣處理組(ZJPRE)、對(duì)照組(ZJCON)3種處理下的棗果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)氫氧化鈣處理?xiàng)椆?，棗果外觀接近于正常棗果；CALR、CRT兩種蛋白的表達(dá)量有趨于正常的趨勢(shì)?；诖耍狙芯空J(rèn)為棗黑頂病的發(fā)生可能與CALR、CRT兩種鈣相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)系。該結(jié)論為今后更好地研究棗黑頂病提供依據(jù)。

致謝：感謝山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)棗品種資源圃為本試驗(yàn)提供樣地。