王悅星，鄭世茂，王業(yè)文，李培江， 張 羽，于月華

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000；3.陜西省水稻研究所，陜西漢中 723000)

陜南地區(qū)為秈稻優(yōu)生區(qū)，該地區(qū)秈稻種質(zhì)資源遺傳背景分析對(duì)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗秈稻新品種的選育具有重要意義。從最早的形態(tài)標(biāo)記到DNA分子標(biāo)記，遺傳標(biāo)記在群體遺傳基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了重大作用。過(guò)去幾十年來(lái)，簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeats，SSRs)技術(shù)由于所需 DNA量少、在基因組分布較多(大約每隔10～50kb就存在1個(gè)SSR)、呈共顯性遺傳等特點(diǎn)成為研究群體遺傳背景的主要DNA標(biāo)記，SSR標(biāo)記也成為中國(guó)主要農(nóng)作物品種指紋鑒定圖譜中心的指定標(biāo)記，在水稻、小麥、油菜、玉米等植物新品種鑒定、新品種保護(hù)等DNA指紋圖譜檢測(cè)中都使用SSR標(biāo)記[1-4]。基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，在真核生物基因組中多態(tài)性最高的DNA多態(tài)性為單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNPs)，水稻基因組中大約每幾百bp，甚至幾十bp就有1個(gè)SNP[5-7]。相比之下，SSR標(biāo)記顯示出數(shù)量少、在基因組分布不平衡、電泳分辨能力弱，費(fèi)時(shí)費(fèi)力等因素，阻礙了高密度遺傳圖譜的構(gòu)建及相關(guān)生物學(xué)問(wèn)題的研究。近年來(lái)，二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得SNPs的檢測(cè)變得容易，針對(duì)多態(tài)性低及富含高重復(fù)序列物種[8-10]，用全基因組測(cè)序性價(jià)比低的問(wèn)題，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用而生，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)大部分是基于RAD tags(Restriction site Associated DNA)，進(jìn)行高通量測(cè)序[11-15]，大幅降低基因組的復(fù)雜度，尤其適合于大樣本量的研究，可快速鑒定出高密度的變異，特別是SNPs變異。其中Genotyping-by-sequencing(GBS)技術(shù)能成為當(dāng)前簡(jiǎn)化基因組測(cè)序主流技術(shù)的原因之一就是它選用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶(Ⅱ型酶)[16-17]，很好地避開基因組主要的重復(fù)區(qū)域(甲基化區(qū)域)，通過(guò)選擇單拷貝區(qū)RAD tags 測(cè)序研究其SNPs多態(tài)性，其結(jié)果在基因分型、連鎖圖譜構(gòu)建、QTLs定位、系統(tǒng)進(jìn)化、生物多樣性、全基因組關(guān)聯(lián)等生物研究領(lǐng)域中受到重視。隨著SNPs的大量獲得，研究發(fā)現(xiàn)生物在遺傳過(guò)程中通常是一種遺傳標(biāo)記的非隨機(jī)性組合，是很多SNPs聯(lián)系在一起作為一個(gè)整體(而不是隨機(jī)組合)往下傳遞，即連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)，當(dāng)位于同一條染色體上的兩個(gè)位點(diǎn)或等位基因同時(shí)存在的概率大于群體中因隨機(jī)分布而同時(shí)出現(xiàn)的概率時(shí)，就稱這兩個(gè)位點(diǎn)處于LD狀態(tài)，也稱單體型(Haplotype)，人類中的Haplotype圖譜構(gòu)建于2005年[18]，植物中構(gòu)建的第1個(gè)Haplotype是2009年在玉米中實(shí)現(xiàn)的[19]。往往調(diào)控某性狀發(fā)育相關(guān)的基因組成的基因簇就在1個(gè)Haplotype中，Haplotype很可能作為功能單位在起作用，所以Haplotype的研究可以加深對(duì)研究性狀發(fā)育通路的認(rèn)識(shí)[20-21]。同時(shí)，由于Haplotype包含許多SNPs的遺傳信息，在全基因組關(guān)聯(lián)研究中，采用Haplotype比單個(gè)SNP具有更好的統(tǒng)計(jì)分析效果，能降低自由度。本研究以具有代表性的198份秈稻材料為對(duì)象，利用NlaⅢ和MseⅠ限制酶分別酶切基因組DNA，對(duì)產(chǎn)生的Tag進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，進(jìn)行SNPs分型、Haplotype構(gòu)建、聚類分析、群體結(jié)構(gòu)分析等研究，從而全面、準(zhǔn)確揭示秈稻材料的遺傳多態(tài)性水平，研究為秈稻數(shù)量性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析、秈稻的遺傳改良以及秈稻雜交育種中優(yōu)良雜交親本的選配具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

198份秈稻種質(zhì)資源來(lái)源于2017-2019年生長(zhǎng)在陜西省水稻研究所試驗(yàn)地的秈稻幼嫩葉片，包括恢復(fù)系材料112份，保持系49份，不明恢保關(guān)系材料37份。測(cè)序前液氮保存。

1.2 方 法

1.2.1 GBS測(cè)序 DNA提取、GBS文庫(kù)準(zhǔn)備、測(cè)序等步驟參考Illumina Hiseq 2000 測(cè)序平臺(tái)操作要求。由北京諾和基因生物信息技術(shù)有限公司承擔(dān)。

1.2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與分析 缺失值小于0.3，MAF(Minor Allele Frequency)大于0.05，SNP位點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)程度r2值取值0.8，LOD取值3。兩個(gè)酶切合并后的SNPs有91 421(包含Scaffold)個(gè)，Mapped到染色體上的SNPs有85 525個(gè)。198個(gè)材料全基因組雜合基因型位點(diǎn)占 4.95%，MAF平均為0.19。

1.2.3 LD分析和Haplotype構(gòu)建 用PLINKv 1.07命令“--r2”運(yùn)行LD，r2>0.8的配對(duì)SNP構(gòu)建Haplotype，用PLINKv1.07命令“--blocks”運(yùn)行Haplotype block，Haploview4.2可視化PLINKv1.07結(jié)果。R語(yǔ)言繪制密度分布圖和熱圖。

1.2.4 全基因組的KEGG分析 用KAAS(KEGG automatic annotation server)在線軟件 (https://www.genome.jp/tools/kaas/)進(jìn)行秈稻全基因組KEGG分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組SNPs分析

198個(gè)秈稻材料的85 535個(gè)SNP在12條染色體上的分布不平衡(圖1-a)，1號(hào)染色體上最多(10 369個(gè))；10號(hào)染色體最少(4 893個(gè))，10號(hào)染色體在進(jìn)化過(guò)程中可能較保守。同時(shí)，每條染色體上的SNP分布密度也不同(圖1-b)，SNP密度高的區(qū)域?qū)?yīng)著多態(tài)性豐富區(qū)，此區(qū)域進(jìn)化速率較快。

2.2 連鎖不平衡分析及Haplotype的構(gòu)建

全基因組r2大于0.2的SNPs有421 787對(duì)，r2平均值為0.79，r2大于等于0.8的有 264 171對(duì)(占62.63%)，r2等于1的有100 959對(duì)(占23.94%)。2個(gè)SNPs位點(diǎn)間相關(guān)(r2≥ 0.2)的平均距離為18 626 bp，r2小于0.8的平均距離為22 400 bp，r2大于等于0.8的平均距離為16 374 bp，r2等于1的平均距離為11 556 bp。本研究2個(gè)SNP位點(diǎn)間距離≤500 kb的r2平均值為0.79。由此看出：LD隨著2個(gè)SNP位點(diǎn)間的距離增大而衰減。從單條染色體和全基因組r2和2個(gè)SNP位點(diǎn)間距離的關(guān)系圖也可以看出：隨著物理距離的增加，2個(gè)SNP位點(diǎn)間的r2越小，即連鎖強(qiáng)度越小，甚至沒有(圖2-a)。

12條染色體共有6 981個(gè)Haplotype，它們?cè)?2條染色體上的數(shù)目分布見圖2-b，其中1號(hào)染色體上的Haplotype最多(791個(gè))，10號(hào)染色體上的最少(396個(gè))。1個(gè)Haplotype最多由91個(gè)SNPs組成，最少2個(gè)SNPs組成。最長(zhǎng)Haplotype跨越189.935 kb，最短跨越2 bp。在基因組中，關(guān)聯(lián)程度高的Haplotype之間可以組成Haplotype blocks，每個(gè)Haplotype的頻率及其與Haplotype blocks之間關(guān)聯(lián)度高低見圖2-c。

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

生物群體遺傳結(jié)構(gòu)是基因或基因型在空間和時(shí)間上的非隨機(jī)分布，包括群體內(nèi)的遺傳變異和群體間的遺傳分化等多方面內(nèi)容[22]，群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究是探討生物適應(yīng)性、種群形成過(guò)程及其進(jìn)化機(jī)制的基礎(chǔ)，也是制定有效的保護(hù)和開發(fā)利用生物資源的策略及措施的基礎(chǔ),還是進(jìn)行目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)，因?yàn)閺?fù)雜的群體結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致基因型與表型之間關(guān)聯(lián)的假陽(yáng)性。本研究用3種方法對(duì)198份秈稻資源進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。

2.3.1 PC分析 利用TASSEL 5.0軟件進(jìn)行PC分析，結(jié)果顯示前3個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為10.98%、10.47%和4.81%，前2個(gè)PC把198份材料的多數(shù)樣本聚在了一起，結(jié)果見圖3。

2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹 UPGMA法把198個(gè)材料分為2個(gè)亞類，分別包含9個(gè)和189個(gè)材料。兩兩材料間的遺傳距離為0.01～0.60，平均為 0.28。親緣關(guān)系最近的兩個(gè)材料為Z15和Z19-37，最遠(yuǎn)的為Z10和Z19-37(圖4)。

2.3.3 K聚類 用Centered-IBS方法計(jì)算kinship值，R語(yǔ)言繪制熱圖(圖5)。從圖5可以看出，有6個(gè)材料與其他材料的遺傳距離較遠(yuǎn)(左上角紅色部分)，分別為W366、Z12、Z31、Z55、Z19-37和Z5。

2.3.4 基于水稻全基因組的KEGG分析 功能相關(guān)性高的基因通常聚集在1個(gè)連鎖群上以基因簇的形式出現(xiàn)。為了后續(xù)全基因組關(guān)聯(lián)研究深入理解秈稻全基因組SNPs和Haplotype的多態(tài)性與Gene功能之間的關(guān)系，以秈稻基因組(GCA_000004655.2)注釋的37 358個(gè)蛋白為例，分析秈稻全基因組編碼基因參與的代謝途徑(表1)，表1中只列出前3個(gè)代謝途徑。全基因組編碼的基因主要參與核糖體、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路。結(jié)果表明，不同染色體上編碼的基因行使的主要生物學(xué)功能有差異，如連鎖群11和12上編碼的基因主要參與植物-病原菌相互作用，它們的SNPs多態(tài)性也高，特別是連鎖群12，推測(cè)它們?cè)谘莼^(guò)程中富集較多的與病原菌變化互作的SNPs變異。Thermogenesis通路在秈稻代謝通路中也較多，如連鎖群3、7和8可能與秈稻的起源環(huán)境有關(guān)。

表1 基于水稻全基因組的KEGG分析Table 1 KEGG analysis based on whole-genome of rice

3 討論與結(jié)論

在植物遺傳育種研究中，SNPs標(biāo)記以其數(shù)量豐富、遺傳穩(wěn)定性高、富有代表性、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析以及性價(jià)比高等特點(diǎn)已迅速替代SSRs 成為新一代分子標(biāo)記。由于秈稻基因組重復(fù)序列較高，因此使用GBS技術(shù)可以提高秈稻大樣本量測(cè)序識(shí)別SNPs的性價(jià)比。水稻的每一次突破都是種質(zhì)資源中優(yōu)異基因的發(fā)現(xiàn)與挖掘利用，因此，種質(zhì)資源的研究是育種的基礎(chǔ)，研究表明影響植物種群遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素為交配系統(tǒng)，本研究秈稻群體全基因組SNPs雜合基因型位點(diǎn)占 4.95%，表明這些育種材料已經(jīng)純合。雖然該群體的遺傳距離范圍較廣，但平均遺傳距離較小，說(shuō)明本研究秈稻群體基因組的SNPs多樣性低于大豆，該群體適合后續(xù)QTLs(Quantitative Trait Locus)定位。秈稻連鎖群2、3、5、7、12上有幾個(gè)區(qū)域表現(xiàn)出SNPs分布密度大，可能與此區(qū)高重組率有關(guān)，如本地區(qū)長(zhǎng)期的秈稻種植及育種歷史，加之優(yōu)異材料在育種單位之間的廣泛交流與骨干親本的廣泛使用，或是進(jìn)化過(guò)程中與適應(yīng)性有關(guān)。

聚類分析表明，恢復(fù)系和保持系材料并沒有首先分開，可能是各育種單位意識(shí)到保持系親緣窄(目前生產(chǎn)上應(yīng)用的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系多數(shù)帶有珍汕97B、Ⅱ-32B、中9B和崗46B等血緣，或者是以中國(guó)的矮稈早稻品種矮仔占和矮腳南特衍生而成有關(guān))，有意識(shí)將各種資源材料血緣滲到保持系材料中，或者是通過(guò)雜交水稻組合分離保持系材料所致。這個(gè)思路和方法必將豐富保持系遺傳基礎(chǔ)，對(duì)選育有突破性水稻優(yōu)良品種帶來(lái)希望。

群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，除W366、Z12、Z31、Z55、Z19-37和Z5材料之外其余的192份親本材料遺傳基礎(chǔ)單一，遺傳結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，群體分層不明顯。以上研究表明，秦巴地區(qū)水稻育種親本材料在遺傳上相似度較大，遺傳背景較單一，遺傳多態(tài)性不高。研究結(jié)果與張羽等[23]的結(jié)論一致。這可能是各育種單位在選育新品種過(guò)程中相互間的品種資源交流很廣泛，并且育種目標(biāo)又相近等諸多原因，使得育成品種的遺傳基礎(chǔ)相近。遺傳基礎(chǔ)狹窄對(duì)水稻優(yōu)良品種的培育、優(yōu)良性狀的選育以及增產(chǎn)方面帶來(lái)限制。加強(qiáng)種質(zhì)資源創(chuàng)新研究，加大外來(lái)優(yōu)良種質(zhì)的引進(jìn)和利用研究等，是提高品種遺傳多樣性的重要措施；同時(shí)，也是秈稻新品種選育的前提，為秈稻雜交育種提供優(yōu)良種質(zhì)資源。