李麗霞， 逄玉娟， 高 燕， 周淑諾， 姜明媛， 馮 磊， 張立培， 卞?；?/p>

(1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山東 煙臺 264005； 2.昆崳山林場， 山東 煙臺 264112；3.煙臺吉恩生物科技有限公司， 山東 煙臺 264006)

北沙參又名珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)，隸屬于傘形科珊瑚菜屬，國內(nèi)主要分布于山東、內(nèi)蒙古、河北，國外在美洲東海岸、日本、朝鮮亦有分布[1]。北沙參作為臨床常用中藥，屬補陰藥，具有生津滋陰、益氣養(yǎng)陰、利肺益胃的功能，用于治療咽干口渴、肺熱勞嗽、干咳痰血、胃陰不足等癥[2]，對2016年我國出現(xiàn)的寨卡病毒和2020年我國流行的新型冠狀病毒所致癥狀均具有一定療效，且作為針對氣陰兩虛證的基本方藥之一，被應(yīng)用于國家衛(wèi)生健康委員會公布的診療方案中[3-4]。北沙參的年需求量在5 000 t左右，國內(nèi)已有較大面積栽培，市場上主要是人工栽培品種[5]。目前對北沙參開展的研究中所用北沙參絕大多數(shù)為已有的栽培品種，且研究內(nèi)容多集中于種植管理[6-7]、化學(xué)成分[8-9]、藥理作用及臨床應(yīng)用[10-12]方面，而種子分級、質(zhì)量標準和質(zhì)量控制方面仍不完善，對北沙參野生種源開發(fā)以及選種育種等方面亦存較大的研究空間[13]。近年隨著北沙參市場需求量的上漲，合理利用開發(fā)野生北沙參資源，挖掘具有優(yōu)良潛力的種質(zhì)進而培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種成為亟待研發(fā)的課題。因此，本研究從全國北沙參主要分布地區(qū)的山東和遼寧選取5個不同地區(qū)的野生北沙參種子，從種子表型特征及種子萌發(fā)特性方面展開研究，以期為深入了解北沙參種子的萌發(fā)機制以及為北沙參野生種質(zhì)資源進一步開發(fā)利用、選育鑒定優(yōu)質(zhì)種源提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

供試材料于2019年6-7月分別采自山東海陽鳳城 (HY)、即墨田橫島(THD)、日照海濱國家森林公園(RZ)和遼寧瓦房店情人島(QRD)、葫蘆島金石灘(JST)。

1.2 種子長、寬、面積及千粒重測定

隨機選取不同種源果實各30粒，用智能考種分析系統(tǒng)測長、寬和面積，重復(fù)3次；以上果實每次測定完成后去掉果皮，得到的種子用同樣的方法測定相應(yīng)的參數(shù)。隨機選取不同種源果實各1 000粒，用電子天平稱量果實千粒重，剝掉果皮后繼續(xù)稱量種子的千粒重，重復(fù)3次。

1.3 種子萌發(fā)實驗

隨機選取足量的不同種源北沙參果實，置于4 ℃冰箱內(nèi)濕沙貯藏4個月，使實驗的種子均經(jīng)過低溫后熟的過程，翌年4月剝?nèi)スぃM行發(fā)芽實驗。利用恒溫培養(yǎng)箱設(shè)置5個溫度梯度(10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃)，每個溫度放置種子30粒，置于平皿內(nèi)潤濕的雙層濾紙上進行種子萌發(fā)，胚根長至種子2倍長度為發(fā)芽標準。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

分別在種子播種后3 d、5 d、7 d時，對20 ℃、25 ℃和30 ℃處理的5個種源種子的發(fā)芽粒數(shù)進行統(tǒng)計，15 ℃處理所有種子繼續(xù)統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)至第10天，10 ℃處理所有種子持續(xù)統(tǒng)計第13天、第16天直至第19天，以連續(xù)3 d無新種子發(fā)芽視為萌發(fā)結(jié)束。根據(jù)發(fā)芽種子數(shù)與供試種子總數(shù)的比值來計算發(fā)芽率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

利用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對各數(shù)據(jù)均值進行單因素方差分析(多重比較采用Duncan檢驗)及相關(guān)性分析，測定數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源北沙參果實和種子的特征

由表1可知，不同種源北沙參的果實面積、果實長度、果實寬度大小排序依次為：田橫島>日照>海陽>情人島>金石灘；果實千粒重大小排序依次為：日照>田橫島>海陽>情人島>金石灘。統(tǒng)計分析表明，在果實大小的多個測定指標包括果實長度、面積及重量上，金石灘種源的北沙參測定值顯著低于其他種源的果實的相應(yīng)值(p<0.05)。果實較大的為日照及田橫島種源的北沙參，但二者千粒重數(shù)值接近，其差異并未達到顯著水平(p>0.05)，而與其他種源的果實千粒重差異均達到顯著水平(p<0.05)。

表1 不同種源北沙參果實形態(tài)指標

不同種源北沙參種子的形態(tài)指標見表2。分析可知，種子面積大小及種子長度排序依次為：田橫島>日照>海陽>情人島>金石灘；種子寬度由大小排序依次為：日照>田橫島>情人島>海陽>金石灘；種子千粒重大小排序依次為：田橫島>日照>海陽>金石灘>情人島，其中田橫島種子千粒重為最大值9.71 g，其重量達到最小值即情人島種子千粒重的1.42倍。通過差異顯著性分析可知，在種子寬度和面積及千粒重指標測定中，情人島及金石灘種源的北沙參種子均顯著低于田橫島及日照種源的種子(p<0.05)。

表2 不同種源北沙參種子形態(tài)指標

注：A為面積；B為長度；C為寬度；D為千粒重。下同。圖1 不同種源北沙參果實特征與緯度的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of fruit characteristics and latitude of G. littoralis from different provenances

2.2 不同種源北沙參果實和種子特征與緯度的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果(圖1)表明，緯度與北沙參果實面積、長度和寬度均呈顯著負相關(guān) (p<0.05)，與千粒重呈極顯著負相關(guān) (p<0.01) (圖1)。對于北沙參種子來說，緯度則僅與種子千粒重呈顯著負相關(guān) (p<0.05)，與種子面積、長度及寬度的相關(guān)性均未達到顯著水平(p>0.05) (圖2)。

圖2 不同種源北沙參種子特征與緯度的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between seed characteristics and latitude of G. littoralis from different provenances

2.3 不同溫度下各種源北沙參種子的發(fā)芽率差異分析

對不同種源北沙參種子在不同統(tǒng)計天數(shù)的發(fā)芽率數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，由圖3 A可知，在10 ℃處理下， 3 d時僅有金石灘極少量種子發(fā)芽；隨著發(fā)芽時間延長，其他種源種子的發(fā)芽率緩慢增加，而金石灘種子發(fā)芽率增加較快，5～10 d統(tǒng)計的金石灘種子的發(fā)芽率均顯著高于其他種子(p<0.05)；至發(fā)芽13 d時，情人島種子的發(fā)芽率亦穩(wěn)定增加，與金石灘種子的發(fā)芽率愈來愈接近(p>0.05)，而二者的發(fā)芽率明顯高于其他種源種子的發(fā)芽率(p<0.05)，16 d及19 d發(fā)芽統(tǒng)計結(jié)果同樣如此(p<0.05)。

由圖3 B可知，15 ℃處理下，各種源種子的3 d發(fā)芽率均很低，且無顯著性差異(p>0.05)；5 d時，金石灘種子的發(fā)芽率即顯著高于其他種源種子的發(fā)芽率(p<0.05)；至發(fā)芽7 d時，金石灘和情人島種子的發(fā)芽率明顯高于其他種源種子的發(fā)芽率(p<0.05)，而二者之間差異并未達到顯著水平(p>0.05)。統(tǒng)計至發(fā)芽10 d時，金石灘和情人島種子的發(fā)芽率與其他種源發(fā)芽率均存在顯著性差異，海陽種子發(fā)芽率則與田橫島及日照種源的發(fā)芽率亦達顯著性差異(p<0.05)。

20 ℃處理下，各種源種子的3 d發(fā)芽率即表現(xiàn)出差異，其中，金石灘和情人島種子的發(fā)芽率顯著高于其他種源種子(p<0.05)；5 d時，金石灘種子的發(fā)芽率明顯增加，與其他種源種子的發(fā)芽率均存在顯著性差異(p<0.05)；統(tǒng)計至7 d時，金石灘和情人島種子的發(fā)芽率明顯高于其他種源發(fā)芽率(p<0.05)，而二者之間

注：A為10 ℃；B為15 ℃；C為20 ℃；D為25 ℃；E為30 ℃。圖3 不同種源北沙參種子在不同溫度及不同發(fā)芽天數(shù)的發(fā)芽率 Fig.3 Comparison of germination rate of G. littoralis seeds from different provenances at different temperatures and germinating days

無顯著性差異(p>0.05)，日照種子發(fā)芽率最低，與其他種源種子發(fā)芽率均存在顯著性差異(p<0.05)(圖3 C)。

不同種源北沙參在25 ℃處理下隨發(fā)芽天數(shù)的發(fā)芽率見圖3 D。由圖可知，各種源種子的3 d發(fā)芽率中，金石灘和情人島種子的發(fā)芽率顯著高于其他種源種子的發(fā)芽率(p<0.05)；5 d時，金石灘種子的發(fā)芽率繼續(xù)快速增加，和情人島種子發(fā)芽率差異亦達到顯著水平(p<0.05)，而日照、海陽及田橫島種子的發(fā)芽率之間無顯著性差異(p>0.05)；7 d時，金石灘和情人島種子的發(fā)芽率明顯高于其他種源種子的發(fā)芽率(p<0.05)，而二者之間差異未達到顯著水平(p>0.05)。

30 ℃較高溫度下，3 d與5 d時僅有情人島的種子發(fā)芽且發(fā)芽率在5 d和7 d時未發(fā)生變化，7 d時金石灘種子的發(fā)芽率略高于情人島種子的發(fā)芽率，但相互之間并無顯著性差異(p>0.05)(圖3 E)。

2.4 不同溫度下各種源北沙參種子的最終發(fā)芽率及其與緯度的相關(guān)性

本研究的最終發(fā)芽率為10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃各處理下種子萌發(fā)試驗結(jié)束時間對應(yīng)的發(fā)芽率的平均值，用以綜合直觀的體現(xiàn)各溫度下的發(fā)芽率。由圖4可知，不同種源種子的最終發(fā)芽率與緯度呈顯著正相關(guān)(p<0.05)。

圖4 緯度與北沙參種子最終發(fā)芽率的相關(guān)性Fig.4 Correlation analysis of latitude and final germination rate of G. littoralis seeds

3 討 論

近年來，野生北沙參資源量大幅縮減，瀕危狀況日益嚴重，1999年被《國家重點保護野生植物名錄(第一批)》列為Ⅱ級瀕危重點保護植物[14]。北沙參分布數(shù)量銳減的原因除了由于生境破壞、野生種群較小及分布生境狹閾等原因外，種子萌發(fā)率低也是重要原因之一[7]。因此，合理利用野生北沙參資源，根據(jù)種子發(fā)芽率挖掘優(yōu)良潛力的種質(zhì)具有積極的現(xiàn)實意義。研究發(fā)現(xiàn)，北沙參種子的發(fā)芽率較低，而北沙參后續(xù)相關(guān)研究進展緩慢，亦主要受限于北沙參種子的發(fā)芽率不高[15-16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同種源北沙參種子的發(fā)芽率不同且與緯度呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，比如日照種源的種子發(fā)芽率較低，但隨著緯度的增加，北沙參種子的發(fā)芽率呈增加趨勢。由此可見，北沙參種子的發(fā)芽率與種源的地理特征之間，特別是與緯度有一定的聯(lián)系。在種子分級的各項指標中，發(fā)芽率最為重要，可以較為直接地反映種子的田間出苗率[17]。因此，發(fā)芽率可以作為北沙參選種的重要依據(jù)，發(fā)芽率高的種源，即遼寧省瓦房店情人島和葫蘆島金石灘兩地的野生北沙參可作為具有潛力的優(yōu)勢種質(zhì)加以重點關(guān)注。

本研究表明，不同種源北沙參果實和種子的形態(tài)指標存在一定的差異，低緯度種源如日照、田橫島的果實和種子的面積和質(zhì)量均較大，高緯度種源如金石灘及情人島的果實和種子的面積和質(zhì)量均較小，即隨著緯度的增加，北沙參種子的面積、長、寬和千粒重均呈減小的趨勢。由此可見，北沙參種子的表型性狀與緯度有一定的聯(lián)系，但果實、種子與緯度相關(guān)性分析的結(jié)果表現(xiàn)不同。緯度與北沙參果實面積、長度和寬度均呈顯著負相關(guān)(p<0.05)，與千粒重呈極顯著負相關(guān) (p<0.01)。緯度則與種子面積、長度及寬度的相關(guān)性均未達到顯著水平(p>0.05)，僅與種子千粒重相關(guān)顯著 (p<0.05)?？赡苁怯捎诒鄙硡⒏鞣N源間的差異，更多體現(xiàn)在果皮的大小及質(zhì)量差異較大，所以導(dǎo)致剝掉后無法很好地體現(xiàn)各形態(tài)指標間與緯度的相關(guān)性。

溫度對不同種源北沙參種子的發(fā)芽率均有較大影響。低溫下各種源的北沙參種子萌發(fā)較為緩慢，因此15 ℃統(tǒng)計至10 d，而最低溫度處理10 ℃統(tǒng)計至19 d后連續(xù)3 d未有新種子萌發(fā)，發(fā)芽率才達到恒定不變，且在低溫脅迫下胚根生長極其緩慢，和正常溫度下生長的狀態(tài)具有較大差別。發(fā)芽速度較快、發(fā)芽率最高的溫度為20 ℃和25 ℃，而在30 ℃下各種源種子均無法正常萌發(fā)。本研究結(jié)果與Picciau等[18]的研究結(jié)論較為一致。溫度對北沙參種子萌發(fā)具有較大影響，又因為北沙參具有耐寒的特點[19]，因此北沙參種子在萌發(fā)階段溫度可以略低，但必須要避免高溫，盡量保持一個適宜的溫度以保證較高的發(fā)芽率。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著種子千粒重的不斷增加，北沙參種子的發(fā)芽率不斷明顯降低，可能有以下幾個原因：首先，北沙參種子屬于深度休眠的類型，相關(guān)研究表明，北沙參的種子內(nèi)含有大量的香豆素類成分，是北沙參主要的活性成分之一[20-21]，包含多種化學(xué)物質(zhì)，被視為傘形科中藥特征性的成分，亦是最早一批被確定為誘導(dǎo)植物休眠的物質(zhì)之一[22]，可能會極大地抑制種子的萌發(fā)，因此可能因為種子千粒重較大的北沙參種源種子中香豆素類成分含量較千粒重小的種源高，所以導(dǎo)致種子萌發(fā)被極大地抑制，本實驗室同時開展的北沙參種子切掉一半胚乳的對比萌發(fā)實驗為本研究結(jié)果提供了佐證(另文)，不同種源北沙參香豆素典型成分的含量測定工作亦正在進行之中；其次，北沙參種子在儲存期間的含水量高低會對后續(xù)的萌發(fā)產(chǎn)生較大的影響，在種子的含水量過高時，種子可能會發(fā)熱、變質(zhì)易發(fā)生霉變，因此千粒重較大的北沙參種源種子中的含水量較千粒重小的種源高，致使部分種子變質(zhì)或失活，從而導(dǎo)致發(fā)芽率較低[23]；日照及田橫島種源的種子出現(xiàn)較高的霉變率，尤其在較高溫度(20 ℃及25 ℃)下，而在較低溫度下霉變情況較為輕微；此外，因為地理隔離和復(fù)雜多樣的氣候、土壤、地形等生態(tài)因子的差異，可能會導(dǎo)致不同種源種子間在某些性狀上產(chǎn)生了一定的遺傳分化，促使不同種源發(fā)生了種內(nèi)變異[24]，但其具體機制仍需要進一步研究分析。

綜上所述，不同種源北沙參的種子表型特征與緯度相關(guān)，相比而言，高緯度種源北沙參種子及果實的面積和質(zhì)量較小，且其千粒重與緯度均呈顯著負相關(guān)(p<0.05)；北沙參種子發(fā)芽率與緯度呈顯著正相關(guān)(p<0.05)，萌發(fā)的適宜溫度范圍為20～25 ℃；遼寧省兩地區(qū)的野生北沙參種源發(fā)芽率要優(yōu)于山東省三地區(qū)的野生北沙參種源。此結(jié)果可為優(yōu)質(zhì)北沙參種源的選育選材提供有效參考。