劉世光，田伶伶，史冬梅，王 聰，劉 聰

(1.遼陽市中心醫(yī)院腫瘤內科，遼寧 遼陽 111000；2.遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤內科，遼寧 沈陽 110000；3.鐵嶺市中心醫(yī)院腫瘤內科，遼寧 鐵嶺 112000)

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的消化系統惡性腫瘤，發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第5位[1]。胃癌根據癌灶部位分為胃底賁門癌、胃體癌、胃竇癌等[2]。當前胃癌的治療方案主要包括手術和化學治療，但術后輔助化學治療長期治療效果并不理想，據報道大約50%的胃癌手術患者腫瘤會復發(fā)[3]，且不良反應多，耐藥率高，中位總生存期不盡如人意[4]。因此，傳統的胃癌治療方案不能滿足臨床需求，必須探索新的治療方法。

在胃癌的研究進展中，已經發(fā)現了許多與胃癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移有關的蛋白，但卻很少被實際應用于臨床，因此，加強對功能基因應用的研究將有益于胃癌治療策略的制定。叉頭框蛋白D3(Forkhead box D3，FoxD3)是FOX家族成員之一，具有保持胚胎干細胞多能性，調節(jié)腫瘤的增殖、侵襲、血管形成和遷移的作用，且在多種腫瘤中異常表達[5-6]。已有研究表明FoxD3在胃癌組織中高表達，并可能通過Wnt/β-catenin信號促進胃癌的發(fā)生發(fā)展[7]。但FoxD3在胃癌中的具體作用機制仍不清楚。本文通過干擾FoxD3，探討其對胃癌細胞SGC-7901生長、運動及上皮間質轉化的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(61870-127)、胎牛血清(10099-141)、胰蛋白酶(15050-057)和青—鏈霉素(15140-122)均購自美國賽默飛世爾科技公司；永生化胃黏膜上皮細胞系GES和人胃腺癌細胞SGC-7901購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)購自上海碧云天生物技術研究所；Transwell(3374)購自美國Corning公司；兔抗FoxD3(ab64807)、Ki67(ab15580)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA，ab18197)、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin，ab15148)、神經鈣黏蛋白(N-cadherin，ab18203)、波形蛋白(Vimentin，ab137321)、β-actin(ab8227)單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將GES細胞和SGC-7901細胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中用高糖RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青—鏈霉素)培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)基，收集細胞時用0.25%胰蛋白酶消化，試驗選用對數生長期細胞。

1.3 細胞處理及分組

設計3條不同的shRNA序列干擾片段(FoxD3-shRNA1、FoxD3-shRNA2和FoxD3-shRNA3)轉染至SGC-7901細胞干擾FoxD3表達。通過Western blot和RT-PCR實驗選擇最佳干擾序列shRNA2進行后續(xù)實驗。細胞隨機分為Control組、shRNA-NC組和FoxD3-shRNA2組。Control組不作處理，shRNA-NC組轉染空質粒，FoxD3-shRNA2組轉染shRNA2。

1.4 RT-PCR檢測相關mRNA表達

用TRIzol法從各組SGC-7901細胞中提取總RNA，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用FastKing RT試劑盒通過標準反應進行mRNA的逆轉錄，使用Fast qPCR Mix進行實時PCR，反應條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s。FoxD3-shRNA1 F：5’-AGCAAGCCCAAGAATAGC-3’，R：5’-TC CAGGGTCCAGTAGTTG-3’；FoxD3-shRNA2 F：5’-AGC GCCAGCGATATGTCCG-3’，R：5’-TGCCAGGGCTTGC GGTTGA-3’；FoxD3-shRNA3 F：5’-ACTCTGCCTCTCC CCAATTT-3’，R：5’-CCATCCCCACGGTACTAAGA-3’；β-actin F：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，R：5’-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。以β-actin為內參，用2-ΔΔCT方法進行定量計算。

1.5 克隆形成法檢測細胞克隆形成率

將SGC-7901細胞接種至6孔板，每孔約500個細胞，培養(yǎng)7 d后棄掉上清液，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色15 min，洗凈干燥后于顯微鏡下觀察各組克隆形成數目，計算克隆形成率。細胞克隆形成率(%)=細胞克隆總數/接種細胞數×100%。

1.6 Transwell檢測侵襲細胞數

取無血清培養(yǎng)基稀釋的人工基底膜，加入Transwell上室，37 ℃風干。取對數生長期的SGC-7901細胞，上室中加入200 μL細胞懸液，下室中加500 μL含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，棉簽擦去基質膠和上室細胞，多聚甲醛固定后染色。光學顯微鏡下計數并拍照，每個樣本隨機選取5個視野。

1.7 劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合率

按1.3所述方法分組處理SGC-7901細胞后，將細胞接種于6孔板，當細胞長滿約80%時用中槍頭垂直于6孔板水平劃線，PBS緩沖液清洗3次后，加入無血清的培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取樣拍照。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.8 上皮間質轉化形態(tài)學觀察

取各組對數生長期細胞，通過顯微鏡觀察各組細胞上皮間質轉化形態(tài)學變化。

1.9 Western blot檢測相關蛋白表達

各組細胞加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白轉移至PVDF膜。4 ℃下加入FoxD3、Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗(1∶1 000)孵育過夜，TBST清洗后加入HRP-IgG(1∶10 000)，加入電化學發(fā)光顯色液顯色。以β-actin為內參，Image J V1.8.0.112軟件分析各組細胞目的蛋白與β-actin比值。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 FoxD3 mRNA和蛋白表達水平

與GES細胞比較，SGC-7901細胞中FoxD3 mRNA水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1a；與Control組比較，FoxD3-shRNA1組、FoxD3-shRNA2組、FoxD3-shRNA3組細胞中FoxD3 mRNA水平均降低，FoxD3-shRNA2組mRNA水平最低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1b。選擇最佳干擾序列shRNA2進行后續(xù)實驗，結果顯示，與Control組比較，FoxD3-shRNA2組FoxD3蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1c。

a：RT-PCR檢測GES細胞和SGC-7901細胞中FoxD3 mRNA水平；b：RT-PCR檢測3個FoxD3 shRNA中FoxD3 mRNA水平；c：Western blot檢測FoxD3蛋白表達水平 *：與GES細胞比較，P<0.05；#：與Control組比較，P<0.05

2.2 shRNA-FoxD3抑制SGC-7901細胞增殖

與Control組比較，FoxD3-shRNA2組細胞克隆形成率降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 shRNA-FoxD3下調SGC-7901細胞中Ki67、PCNA蛋白表達水平

與Control組比較，FoxD3-shRNA2組Ki67、PCNA蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 shRNA-FoxD3降低SGC-7901細胞侵襲能力

與Control組比較，FoxD3-shRNA2組侵襲細胞數減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

2.5 shRNA-FoxD3抑制SGC-7901細胞遷移

與Control組比較，FoxD3-shRNA2組細胞劃痕愈合率降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

2.6 shRNA-FoxD3抑制SGC-7901細胞上皮間質轉化

Control組及shRNA-NC組細胞呈分散的類圓或紡錘體樣，細胞之間黏附力降低，大量細胞由上皮向間質轉化，FoxD3-shRNA2組細胞排列緊密，少數細胞呈間質細胞形態(tài)，與Control組比較，FoxD3-shRNA2組上皮間質轉化受到抑制，見圖6。

a：克隆形成實驗檢測各組SGC-7901細胞克隆情況(×200)；b：半定量分析各組SGC-7901細胞克隆形成率 *：與Control組比較，P<0.05

2.7 shRNA-FoxD3上調SGC-7901細胞中E-cadherin蛋白表達，下調N-cadherin、Vimentin蛋白表達

與Control組比較，FoxD3-shRNA2組E-cadherin蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)；N-cadherin、Vimentin蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

a：Western blot檢測各組SGC-7901細胞中Ki67、PCNA蛋白表達；b：半定量分析各組SGC-7901細胞Ki67、PCNA蛋白表達 *：與Control組比較，P<0.05

a：Transwell檢測各組SGC-7901細胞侵襲細胞數(×200)；b：半定量分析各組SGC-7901細胞侵襲細胞數 *：與Control組比較，P<0.05

a：劃痕實驗檢測各組SGC-7901細胞遷移(×200)；b：半定量分析各組SGC-7901細胞劃痕愈合率 *：與Control組比較，P<0.05

圖6 shRNA-FoxD3對SGC-7901細胞上皮間質轉化的影響(×200)

3 討論

胃癌是具有高度侵入性和攻擊性的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命和健康[8]。尋找胃癌早期診斷及治療的方案具有重要意義。已有研究表明，FoxD3可預測胃癌患者的預后[9]。FoxD3可能是繼CD44v6的另一種特異性胃癌干細胞表面標記物，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移、分化、增殖和凋亡中起重要作用[10]。

a：Western blot檢測各組SGC-7901細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達；b：半定量分析各組SGC-7901細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達 *：與Control組比較，P<0.05

胃癌細胞早期就易發(fā)生轉移，主要是由于胃癌細胞增殖能力極強[11]。抑制胃癌細胞增殖是控制胃癌進展的關鍵。Ki67是一種增殖細胞核相關抗原，其水平高低可反映細胞的增殖狀態(tài)，相關研究表明Ki67在胃癌組織中高表達[12]。PCNA是一種與細胞增殖狀態(tài)有關的核蛋白，隨著臨床分期增加和淋巴結轉移的發(fā)生，其表達水平逐漸增高，可反映癌細胞增殖情況及所處細胞周期[13]。本研究Western blot結果顯示，轉染shRNA-FoxD3載體后，SGC-7901細胞中Ki67、PCNA蛋白表達降低，提示敲低FoxD3表達可抑制SGC-7901細胞增殖。

胃癌細胞的高遷移率致使患者術后易發(fā)生局部侵襲甚至轉移，這也是造成胃癌患者死亡的直接原因[14]。劉四衛(wèi)等[5]研究發(fā)現，FoxD3過表達可抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。朱婧等[15]研究發(fā)現，原發(fā)性直腸癌組織中FoxD3蛋白表達低于正常組織，且與結腸癌腫瘤的發(fā)展及預后相關。本研究通過Transwell和劃痕愈合實驗發(fā)現，轉染shRNA-FoxD3載體后，SGC-7901細胞侵襲細胞數和劃痕愈合率均降低，提示敲低FoxD3表達可抑制SGC-7901細胞侵襲和遷移。

上皮間質轉化是正常上皮細胞轉變?yōu)殚g質表型細胞的過程，胃癌細胞的侵襲轉移及腫瘤干細胞特性與上皮間質轉化過程密切相關[16]。上皮間質轉化在胃癌組織和細胞中均表現為上皮細胞標志蛋白E-cadherin表達的降低和間充質細胞標志蛋白N-cadherin、Vimentin的過表達[17]。Benayoun等[18]研究發(fā)現，FoxD3可通過介導上皮間質轉化及腫瘤干細胞的形成，維持腫瘤干細胞特性及腫瘤耐藥。本研究通過Western blot實驗發(fā)現，轉染shRNA-FoxD3載體后，SGC-7901細胞E-cadherin蛋白表達上調，N-cadherin、Vimentin蛋白表達下調，提示敲低FoxD3表達可抑制SGC-7901細胞上皮間質轉化。

綜上所述，shRNA-FoxD3具有抑制SGC-7901細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化的能力。敲低FoxD3表達對防止胃癌的進展具有重要意義。