崔 田

(安徽省蚌埠市食品藥品檢驗中心,蚌埠 233000)

金毛耳草為茜草科植物金毛耳草Hedyotischrysotricha(Palib.)Merr.的干燥全草，又名黃毛耳草，味苦，性涼，歸肝、膽、膀胱、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、利濕消腫的功效，用于腸炎、痢疾、急性黃疸型肝炎等[1]；主要成分為車葉草苷、熊果酸、白樺脂酸、齊墩果酸等[1,2]，有文獻報道，采用高效液相色譜法測定金毛耳草中槲皮素和蘆丁的含量[3-5]，但目前采用HPLC法同時對金毛耳草藥材中活性成分熊果酸與齊墩果酸的含量測定未見報道。本實驗建立了HPLC法同時測定該藥材中熊果酸與齊墩果酸的含量，為該藥材的質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，配有DAD檢測器；CP225D型十萬分之一電子天平、BS210S型萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)。金毛耳草藥材經(jīng)蚌埠市食品藥品檢驗中心張青云副主任中藥師鑒定為茜草科植物金毛耳草Hedyotischrysotricha(Palib.)Merr.的干燥全草。熊果酸對照品(批號：110742-201622，純度：94.7%)，齊墩果酸對照品(批號：110709-201607，純度：91.7%)，均購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純，水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:安捷倫ZORBAX SB-Cl8色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:甲醇-0.2%醋酸溶液(88 ∶12),流速:0.8 ml/min,檢測波長:210 nm;進樣量10 μl;采用外標法進行定量。在上述條件下,齊墩果酸和熊果酸的分離度良好(R=1.64),理論塔板數(shù)均大于5 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取熊果酸對照品、齊墩果酸對照品適量,分別精密稱定19.85 mg和20.12 mg,分別置10 ml和50 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液(熊果酸濃度為1.879 8 mg/ml,齊墩果酸濃度為0.369 0 mg/ml)。精密量取對照品儲備液各1 ml至10 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液(熊果酸濃度為0.187 98 mg/ml,齊墩果酸濃度為0.036 9 mg/ml)。對照品溶液色譜圖見圖1。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末(過2號篩)0.5 g,置具塞錐形瓶中,精密加入乙醇50 ml,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用乙醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,用少量乙醇洗滌濾渣和濾器,合并濾液,蒸干,殘渣加甲醇適量使溶解,轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。供試品溶液色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取熊果酸和齊墩果酸對照品儲備液0.2,0.5,1,2,5 ml,分別至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,得到不同濃度的系列對照品溶液,按“2.1”色譜條件進樣,以對照品濃度為橫坐標(x),色譜峰面積為縱坐標(y),熊果酸和齊墩果酸的線性回歸方程分別為y=178.54x-4.089 1,r=0.999 4;y=57.353x+20.592,r=0.999 1,結(jié)果表明熊果酸、齊墩果酸濃度分別在0.037 6-0.939 9 mg/ml和0.007 4-0.184 5 mg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

取對照品溶液,按“2.1”色譜條件連續(xù)進樣6次,得到熊果酸峰面積的RSD值為0.74%,齊墩果酸峰面積的RSD值為1.38%。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液,分別于0,2,4,6,8 h下進樣測定,得到熊果酸峰面積的RSD值為1.34%,齊墩果酸峰面積的RSD值為1.12%,表明在室溫下放置8 h內(nèi)樣品溶液基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一編號樣品6份,按照“2.2.2”方法制備供試品溶液,按“2.1”色譜條件進樣,測定含量,得到熊果酸含量測定結(jié)果的RSD值為0.65%,齊墩果酸含量測定結(jié)果的RSD值為1.21%。

1.齊墩果酸;2.熊果酸圖1 供試品HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of sample solution

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一編號的樣品6份,各0.25 g,精密加入熊果酸對照品溶液(濃度為1.879 8 mg/ml)0.3 ml和齊墩果酸對照品溶液(濃度為0.369 0 mg/ml)0.4 ml,按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進行測定,計算加樣回收率。熊果酸和齊墩果酸的平均加樣回收率分別為98.61%和97.63%,RSD分別為1.07%和1.13%(見表1和表2)。

表1 熊果酸加樣回收率試驗結(jié)果Table 1 Recovery test results of ursolic acid

表2 齊墩果酸加樣回收率試驗結(jié)果Table 2 Recovery test results of oleanolic acid

2.8 樣品測定

取不同產(chǎn)地的金毛耳草藥材0.5 g,按照“2.2.2”方法制備供試品溶液,按“2.1”色譜條件進行測定,按外標法分別計算樣品中熊果酸與齊墩果酸的含量,結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果 (n=3)Table 3 Determination results (n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

熊果酸與齊墩果酸檢測可以用蒸發(fā)光檢測器也可以用紫外檢測器,紫外的靈敏度更高,而二者最大吸收在近紫外區(qū),波長選擇很關(guān)鍵,參考相關(guān)文獻[6-10],最終選擇210 nm。由于二者都屬于五環(huán)三萜類化合物,結(jié)構(gòu)非常相似,因此,選擇適合的流動相至關(guān)重要。本文查詢了相關(guān)文獻[6-10],比較了甲醇-乙腈-0.05%醋酸銨、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.2%醋酸、甲醇-水等流動相,發(fā)現(xiàn)用甲醇-0.2%醋酸溶液(88 ∶12)時,熊果酸與齊墩果酸分離情況比較好,峰形較好,綜合考慮作為本實驗流動相。降低流速對分離度也有改善,因此選擇流速為0.8 ml/min。

3.2 提取條件的選擇

參考相關(guān)文獻[6-10],對供試品的提取方法進行了考察,比較了甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等不同溶劑及加熱回流、超聲提取方法,結(jié)果表明,乙醇超聲提取效率較高,又簡便易行,因此選擇乙醇超聲作為提取方法。同時對提取時間進行了考查,比較了20,30,40,50 min超聲提取的效率,結(jié)果顯示30 min后含量無明顯變化,故選擇超聲提取30 min。

3.3 樣品測定結(jié)果分析

從樣品含量測定結(jié)果看,不同產(chǎn)地的金毛耳草中熊果酸和齊墩果酸含量差別較大,這可能與氣候、土壤、采收時間等有關(guān),這需要下階段進一步具體研究。本文建立的方法簡便易行,可操作性強,可為金毛耳草藥材質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。