陳 寧，隋云鵬，閻 娜

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100070；2北京大學(xué)首鋼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；*通訊作者,E-mail:yannacn@163.com)

帕金森病(Parkinsin’s disease, PD)是一種進行性的神經(jīng)退行性疾病[1]，而腦深部電刺激(deep brain stimulation，DBS)是近十幾年逐漸發(fā)展起來的一種外科治療方法，被認(rèn)為是運動障礙性疾病治療領(lǐng)域內(nèi)的一個重要的里程碑,丘腦底核(subthalamic nucleus, STN)是目前DBS治療PD的首選治療靶點[2]。既往基礎(chǔ)及臨床研究[3-6]提示STN-DBS對黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元可能具有神經(jīng)保護作用，但是具體保護機制仍不明確。本研究擬建立PD大鼠模型并植入大鼠電刺激器，利用免疫組化、透射電子顯微鏡及免疫印跡等技術(shù)手段，觀察STN-DBS對黑質(zhì)線粒體形態(tài)、功能及線粒體相關(guān)凋亡蛋白影響，探討STN-DBS對6-OHDA引起的黑質(zhì)線粒體損傷的保護作用及機制。

1 實驗方法

1.1 帕金森大鼠模型的建立

選取體質(zhì)量250-300 g健康雄性SD大鼠(購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)32只，隨機分為4組(每組n=8)：對照組、模型組、假刺激組和電刺激組。對照組大鼠左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束僅注射等劑量生理鹽水；模型組大鼠左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束多點注射6-OHDA；假刺激組大鼠左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束多點注射6-OHDA并于模型建立1月后植入STN刺激電極，但不進行電刺激；電刺激組大鼠左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束多點注射6-OHDA并于模型建立1月后植入STN刺激電極同時進行高頻電刺激2個月。將SD大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射進行麻醉，麻醉成功后將大鼠固定在腦立體定位儀上，參照Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜[7]，確定左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束靶點(前囟后3.5 mm，向左旁開0.5 mm,硬腦膜下9.0 mm和前囟后4.4 mm，向左旁開1.5 mm,硬腦膜7.8 mm)，向左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束多點注射6-OHDA(用含0.2%的抗壞血酸的生理鹽水溶解6-OHDA)2.5 μl、3.0 μl，每側(cè)注射時間5 min，留針10 min，緩慢退針。所有操作均在無菌條件下進行，皮膚切開處用青霉素抗菌，縫合傷口。阿撲嗎啡誘發(fā)實驗：給予阿撲嗎啡0.2 mg/kg肌肉注射，注射后觀察3 h，記錄旋轉(zhuǎn)總次數(shù)和每分鐘旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)。平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>7圈/min，認(rèn)為PD大鼠模型建模成功。

1.2 STN電刺激

PD模型建立1個月后，電刺激組及假刺激組于左側(cè)STN坐標(biāo)處[7](前囟后3.8 mm，中線向左旁開2.5 mm,硬腦膜下7.6 mm)植入刺激電極，電刺激組給予持續(xù)電刺激，假刺激組僅植入電極而不給予刺激。刺激參數(shù)為：電壓2.0 V，頻率130 Hz，脈寬60 μs。

1.3 酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化檢測大鼠黑質(zhì)中TH陽性神經(jīng)元數(shù)

3個月后實驗動物處死后取腦，標(biāo)本經(jīng)冰凍切片，進行多巴胺神經(jīng)元(TH)免疫組化染色(ABC法)。切片放入烤箱中60 ℃ 30 min，0.01 mol/L PBST浸洗3次，5 min/次；5%羊血清封閉抗原60 min，放入0.01 mol/L PBST稀釋TH(1 ∶10 000)，室溫過夜；0.01 mol/L PBST浸洗3次，5 min/次；入1 ∶300稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 2-3 h，37 ℃；0.01 mol/L PBST浸洗3次，5 min/次；入1 ∶300稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素三抗2-3 h，37 ℃；0.01 mol/L PBST浸洗3次，5 min/次；浸入配好的DAB顯色液中顯色10-30 min。每只大鼠各取黑質(zhì)相同部位3張，通過Nikon顯微鏡采集圖像，用NIS-Elements圖像分析系統(tǒng)進行分析，根據(jù)灰度值選取TH陽性細(xì)胞，計算黑質(zhì)區(qū)域TH陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.4 透射電鏡觀察黑質(zhì)線粒體結(jié)構(gòu)

標(biāo)本用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定4 ℃ 2 h；二甲砷酸鈉緩沖液(pH7.2)沖洗，10 min×3；1%鋨酸(OsO4)固定2 h；雙蒸水沖洗10 min×3；梯度酒精脫水，50%酒精10 min，70%酒精過夜；90%酒精10 min，100%酒精15 min×2；環(huán)氧丙烷置換15 min；室溫下環(huán)氧丙烷 ∶樹脂1 ∶1，1 h，環(huán)氧丙烷 ∶樹脂1 ∶4,1 h，純樹脂浸透2 h，環(huán)氧樹脂Epon812包埋；聚合：35 ℃ 16 h；45 ℃ 8 h，55 ℃，14 h；65 ℃，48 h；包埋塊修整；1 μm半薄切片，天青一美蘭染色，光學(xué)顯微鏡定位；醋酸雙氧鈾/枸櫞酸鉛染色，Hitachi H-7650透射電子顯微鏡觀察。

1.5 Western blot檢測線粒體相關(guān)凋亡蛋白

線粒體及胞漿成分的提?。悍蛛x中腦黑質(zhì)組織剪碎，按照線粒體/胞漿細(xì)胞組分提取試劑盒(Biovision)操作說明進行線粒體及胞漿成分的提取。取適量線粒體和胞漿成分分別加入10 μl裂解緩沖液中。將裂解液放在冰上孵育30 min，然后再超聲破碎兩次，在4 ℃下以12 000 r/min離心分離，收集上清液，蛋白質(zhì)含量用Bradford方法測定。蛋白質(zhì)樣品用聚丙烯酰胺凝膠電泳。隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜孵育在新鮮的封閉緩沖液中，室溫30 min，然后用一抗Cyto-C(1 ∶1 000)、AIF(1 ∶1 000)、Caspase-3(1 ∶1 000)、Caspase-9(1 ∶1 000)孵育，4 ℃過夜，PBS/Tween 20洗滌3次，加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔IgG抗體，室溫下與雜交膜孵育2 h，PBS/Tween 20洗膜，ECL發(fā)光液進行化學(xué)發(fā)光檢測，Gel-Del凝膠成像系統(tǒng)掃描分析處理。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用方差分析方法分析各組之間的差異，進一步兩兩比較采用SNK-q法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果及STN電刺激對PD大鼠腦組織內(nèi)TH表達(dá)的影響

模型建立1個月后，經(jīng)APO誘導(dǎo)后，正常對照組無明顯旋轉(zhuǎn)現(xiàn)象，而模型組、假刺激組及電刺激組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與正常對照組相比明顯增多(P<0.05)。電刺激治療2個月后，電刺激組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與模型組相比明顯減少(P<0.05)，而假刺激組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與模型組相比無明顯減少(P>0.05)。與模型組相比，電刺激組黑質(zhì)部位的TH陽性細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，而假刺激組與模型組相比，大鼠黑質(zhì)部位TH陽性細(xì)胞無明顯增加(P>0.05，見圖1)。上述結(jié)果表明，STN電刺激可以有效地緩解6-OHDA損傷所導(dǎo)致的大鼠腦組織損傷并改善大鼠的運動功能。

圖1 STN電刺激對6-OHDA損傷模型動物中多巴胺神經(jīng)元(TH)免疫組化分析Figure 1 The expression of nigral TH+ neurons after STN stimulation by immunohistochemistry

2.2 STN電刺激對PD大鼠黑質(zhì)線粒體的影響

通過透射電子顯微鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化，正常對照組的線粒體具有良好的圓形或者卵圓形線粒體結(jié)構(gòu)，線粒體膜結(jié)構(gòu)清晰、線粒體膜內(nèi)嵴排列致密有序；模型組發(fā)現(xiàn)線粒體變得腫脹，線粒體內(nèi)膜內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)消失，結(jié)構(gòu)紊亂，呈空泡樣改變；電刺激組與模型組相比，線粒體結(jié)構(gòu)整體比較完整，保留了有序排列的膜內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)(見圖2)。上述結(jié)果表明，STN電刺激可以緩解6-OHDA損傷所導(dǎo)致的大鼠腦組織黑質(zhì)線粒體損傷。

圖2 透射電子顯微鏡觀察各組黑質(zhì)神經(jīng)元線粒體損傷情況 (×3 000)Figure 2 The structure of mitochondria under transmission electron microscope (×3 000)

2.3 STN電刺激可以有效抑制6-OHDA損傷導(dǎo)致的線粒體凋亡物質(zhì)的釋放

Western blot初步研究結(jié)果表明：與正常對照組相比，模型組可見cleaved-Caspase-3、Caspase-9顯著升高；而電刺激組與模型組相比6-OHDA所導(dǎo)致的cleaved-Caspase-3、Caspase-9的釋放明顯被抑制(P<0.05，見圖3)。通過對線粒體及細(xì)胞漿中cyto-C、AIF的結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞漿中cyto-C、AIF含量與正常對照組相比明顯升高，而電刺激組胞漿中cyto-C、AIF含量與模型組相比明顯減少(P<0.05，見圖4)。但是模型組體線粒體中cyto-C、AIF含量與對照組相比明顯降低，電刺激組線粒體中cyto-C、AIF含量與模型組相比明顯增加(P<0.05，見圖4)。上述結(jié)果表明STN電刺激可以抑制線粒體中cyto-C、AIF等凋亡因子的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

與正常組相比，*P<0.05;與電刺激組相比，#P<0.05圖3 Western blot分析STN電刺激對6-OHDA損傷模型動物黑質(zhì)神經(jīng)元中cleaved-Caspase-3、Caspase-9表達(dá)Figure 3 Effect of STN stimulation on the expression of cleaved-Caspase-3 and Caspase-9 in 6-hydroxydopamince-induced Parkinson’s rats

與正常組相比，*P<0.05;與電刺激組相比，#P<0.05圖4 Western blot分析STN電刺激對6-OHDA損傷模型動物黑質(zhì)神經(jīng)元線粒體及胞漿中cyto-C和AIF含量Figure 4 Effect of STN stimulation on the mitochondrial release of AIF and cyto C in 6-hydroxydopamince-induced Parkinson’s rats

3 討論

帕金森的病理表現(xiàn)主要是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元缺失變性，腦內(nèi)多巴胺遞質(zhì)含量下降，從而導(dǎo)致基底節(jié)環(huán)路調(diào)節(jié)運動的功能發(fā)生障礙[8]。目前臨床上治療PD主要是以左旋多巴類藥物治療為主，然而藥物替代治療僅可以改善患者的一些臨床癥狀，但不能減緩黑質(zhì)神經(jīng)元退行性變的進程，即不能阻止或逆轉(zhuǎn)疾病的病程進展[9]。STN是目前DBS治療PD的首選靶點，既往的臨床研究及動物實驗表明，DBS可能對PD有神經(jīng)保護作用，減緩甚至阻止了病程的進展[3-6]，但是STN-DBS對黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元保護作用的具體機制仍不明確，需要進一步深入、系統(tǒng)的研究。在本研究中我們通過TH免疫組化發(fā)現(xiàn)PD大鼠模型中腦黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞減少，證明6-OHDA可引起PD大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的丟失，而電刺激2個月后，電刺激組明顯增加黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)，進一步證明了STN電刺激對PD大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元具有一定的神經(jīng)保護作用。

既往研究表明，PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡不是壞死而是凋亡，且中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是PD發(fā)病的重要機制之一[10]。細(xì)胞凋亡是一種特殊細(xì)胞死亡過程，它是一個復(fù)雜的過程，其中線粒體被認(rèn)為在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的調(diào)控作用[11,12]。

線粒體不同空間分布不同的酶和生物因子，外膜上有Bcl-2蛋白家族蛋白及離子通道蛋白，膜間隙分布著cyto-C、AIF和procaspase3、9；內(nèi)膜上則是電子傳遞鏈復(fù)合物的聚集部位等。在受到各種因素的刺激后，線粒體的跨膜電位下降甚至消失，線粒體基質(zhì)會釋放出致凋亡活性物質(zhì)進入胞質(zhì)，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)引發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。越來越多的研究表明，線粒體功能障礙在包括PD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病發(fā)生中起重要作用[14]。本研究中，我們通過透射電子顯微鏡從形態(tài)學(xué)水平觀察線粒體結(jié)構(gòu)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-OHDA損傷后可致模型組大鼠黑質(zhì)線粒體變得腫脹，線粒體內(nèi)膜內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)消失，結(jié)構(gòu)紊亂，呈空泡樣改變，提示線粒體功能障礙；電刺激組與模型組相比，可見線粒體結(jié)構(gòu)整體比較完整，保留了有序排列的膜內(nèi)嵴，提示STN電刺激可緩解6-OHDA對線粒體的損傷，具有保護線粒體的功能。而且Western blot初步研究結(jié)果表明：cyto-C、AIF在模型組細(xì)胞漿中明顯升高，而電刺激組胞漿中cyto-C、AIF含量與模型組相比明顯減少，但cyto-C、AIF在模型組線粒體中明顯降低，電刺激組線粒體中cyto-C、AIF含量與模型組相比明顯增加。并且模型組可見cleaved-Caspase-3、Caspase-9顯著升高；而電刺激組與模型組相比cleaved-Caspase-3、Caspase-9的含量明顯降低。這些結(jié)果表明STN電刺激可以通過保護線粒體的功能，從而抑制線粒體中cyto-C、AIF等凋亡因子的釋放，進而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生對黑質(zhì)神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

綜上所述，STN電刺激對6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森大鼠具有神經(jīng)保護作用，它可能是與抑制線粒體的途徑的細(xì)胞凋亡有關(guān)，但是仍需要進一步深入研究。