謝 娜,姬小婷,李子夏,唐成芳,陸 磊,王丹楊*

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科學(xué)教研室,西安 710021;2陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科;3西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:kqwangdy@xiyi.edu.cn)

組織工程技術(shù)在臨床中的應(yīng)用是近年來很多學(xué)者研究的熱點問題之一,由于干細胞具備多向分化的潛能,將干細胞移植在體內(nèi)可用于機體各種組織修復(fù)以及組織再生,因而干細胞在臨床中具有巨大的應(yīng)用潛力[1-3]。

目前,利用干細胞進行活體移植后,干細胞在移植體內(nèi)的歸巢、分化機制是組織工程研究的重點問題,而對所移植的干細胞如何進行有效的標(biāo)記以及示蹤則是開展該項研究的前提[4]。

研究表明,氯甲基苯甲酰氨(氯甲基-1,1-十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基-吲哚-羧花青-高氯酸鹽,chlormethylbenzamido-1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylin-docarbocyamine,CM-DiI)是一種親脂性長鏈碳花青熒光染料,易與細胞膜結(jié)合[5,6]。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)能透過細胞膜快速進入活細胞中與DNA相結(jié)合。因此二者均可用于多種活細胞的標(biāo)記[7,8]。

由于不同種屬、不同來源的細胞生物學(xué)性能有所不同,因此對標(biāo)記物的敏感程度可能也存在著一定的差異。本實驗旨在對比CM-DiI和DAPI這兩種不同的細胞標(biāo)記物對大鼠牙髓干細胞生物學(xué)性能的影響,為進一步的動物實驗提供理論支持,以及為需要進行細胞標(biāo)記以及示蹤的實驗研究提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

選取2個月齡健康的清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠20只,均為雄性,體質(zhì)量為(250±20)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司,美國);Ⅰ型膠原酶、Dispase酶(Gibco公司,美國);波形絲蛋白鼠來源單克隆抗體、角蛋白鼠來源單克隆抗體(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,上海);地塞米松、吲哚美辛、丙酮酸鈉、IBMX、β-甘油磷酸鈉(Sigma公司,美國);CM-DiI、DAPI(Molecu-lar Probe公司,美國);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所,南京);CCK-8細胞毒性檢測試劑盒(博士德公司,武漢);細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國);倒置相差顯微鏡(Nikon公司,日本)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠牙髓干細胞原代培養(yǎng)與純化 10%水合氯醛麻醉后脫頸處死大鼠,在超凈工作臺內(nèi)劈開實驗所用的牙齒,輕柔地取出大鼠的牙髓組織,將其浸泡在按1 ∶1比例混合的Ⅰ型膠原酶和Dispase酶中,用外科手術(shù)剪將牙髓組織均勻剪成0.5-1 mm3大小的組織塊。隨后將其轉(zhuǎn)移至5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中孵育45-60 min,孵育期間每15 min吹打一次消化液,直至組織塊完全消化、溶解。將培養(yǎng)皿中的消化液轉(zhuǎn)移至離心管中,1 000 r/min離心5 min后棄除上清液,加入PBS液重懸沉淀后,再1 000 r/min離心5 min,用此方法漂洗所得的沉淀物2次,用3-4 ml含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中加入100 U/ml青霉素,100 μg/ml鏈霉素和2 mmol/L的L-谷氨酰胺)重懸細胞沉淀,將全部液體轉(zhuǎn)移至60 mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),待有細胞貼壁生長后首次換液,其后每2-3 d更換培養(yǎng)液一次,采用有限稀釋法對所培養(yǎng)的細胞進行純化。

1.2.2 細胞來源鑒定 取生長狀態(tài)良好的第3代大鼠牙髓細胞,調(diào)整細胞密度為1×104個/ml,將其接種至預(yù)先裝有酸處理過的普通蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細胞鋪滿蓋玻片的70%-80%時,按照免疫組化SAB法對其進行角蛋白、波形絲蛋白染色,光學(xué)顯微鏡下觀察、記錄染色結(jié)果。

1.2.3 細胞多向誘導(dǎo)分化實驗

1.2.3.1 成脂誘導(dǎo)分化 使用成脂誘導(dǎo)液(含濃度為0.5 mol/L的IBMX、0.25 μmol/L的地塞米松、10 μmol/L的吲哚美辛、L-谷氨酰胺2 mmol/L、L-抗壞血酸2-磷酸鹽100 μmol/L的DMEM/F12培養(yǎng)基),對第3代大鼠牙髓細胞培養(yǎng)4周后油紅-O染色,倒置顯微鏡下觀察、記錄脂滴的生成情況。

1.2.3.2 成骨細胞誘導(dǎo)分化 使用礦化誘導(dǎo)液(含濃度為10 nmol/L的地塞米松、50 μg/L的維生素C、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、L-谷氨酰胺2 mmol/L的DMEM/F12培養(yǎng)基)對第3代大鼠牙髓細胞培養(yǎng)4周后茜素紅染色,倒置顯微鏡下觀察、記錄礦化結(jié)節(jié)的生成情況。

1.2.3.3 成牙本質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化 取第3代大鼠牙髓細胞使用成骨誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)21 d后,按照堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒說明書進行固定、染色,鏡下觀察。

1.2.4 CM-DiI工作液配制及細胞標(biāo)記 取生長狀況良好的第3代大鼠牙髓干細胞消化離心,調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml,取細胞懸液1 ml,移入離心管內(nèi)。取50 μg裝的CM-DiI一支,溶于0.5 ml的DMSO中,混勻,配為100 μg/ml的母液。

細胞懸液中加入母液,使CM-DiI的終濃度為5 μg/ml。靜置于37 ℃條件下15 min,4 ℃條件下5 min,1 500 r/min離心5 min,棄上清,PBS重懸細胞,1 500 r/min再次離心5 min,以去除未與細胞結(jié)合的染料,加入2 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細胞。

1.2.5 DAPI工作液配制及細胞標(biāo)記 采用CM-DiI工作液的具體配制過程,將配制好的工作液加入細胞濃度為1×105個/ml細胞懸液中,按照CM-DiI細胞標(biāo)記液配置中的具體要求,配制終濃度為5 μg/ml的DAPI細胞標(biāo)記液。

1.2.6 CM-DiI/DAPI標(biāo)記后細胞增殖情況檢測 調(diào)整CM-DiI和DAPI標(biāo)記后的細胞懸液濃度,以2×103個/孔的濃度各自接種于96孔板內(nèi),板內(nèi)每孔含細胞懸液量為200 μl,將此孔的細胞作為實驗組。對照組為未使用標(biāo)記物做過標(biāo)記的細胞,常規(guī)培養(yǎng)。自接種后第1,2,4,7天采用CCK-8檢測試劑盒對所接種的細胞進行細胞增殖檢測,具體操作步驟為:PBS漂洗3遍,每孔加入20 μl的CCK-8液,37 ℃條件下孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值(optical density,OD值),記錄為A值,每組設(shè)有3個復(fù)孔,取平均值。

1.2.7 CM-DiI/DAPI標(biāo)記后LDH釋放檢測 調(diào)整CM-DiI和DAPI標(biāo)記后的細胞懸液濃度,以2×103個/孔的濃度各自接種于96孔板內(nèi),板內(nèi)每孔含細胞懸液量為200 μl,將此孔的細胞作為實驗組。對照組為未使用標(biāo)記物做過標(biāo)記的細胞,常規(guī)培養(yǎng)。分別收集培養(yǎng)12,24,48,72 h的細胞培養(yǎng)液,1 500 r/min離心后取上清,按照LDH試劑盒說明書進行操作,酶聯(lián)檢測儀490 nm波長測定每孔吸光度值OD值。細胞LDH釋放率=(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%;每組設(shè)有3個復(fù)孔,取平均值。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。LDH釋放率以及細胞標(biāo)記后增殖情況采用單因素方差分析進行統(tǒng)計檢驗;檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠牙髓細胞的培養(yǎng)及形態(tài)觀察

采用酶解組織塊法對大鼠牙髓細胞進行原代培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后就可見有少量細胞從組織塊中爬出(見圖1A),3-5 d后細胞就可伸展開來,大多數(shù)伸展開來的大鼠牙髓細胞呈長梭狀,類似于成纖維細胞的形狀;少數(shù)為多角形、橢圓形或者呈現(xiàn)出紡錘形(見圖1B)。

A.培養(yǎng)24 h大鼠牙髓細胞的形態(tài) B.培養(yǎng)3-5 d后大鼠牙髓細胞的形態(tài)圖1 倒置相差顯微鏡下觀察大鼠牙髓細胞的形態(tài) (bar=161 μm)Figure 1 Morphology of rat dental pulp cells observed under inverted phase contrast microscope (bar=161 μm)

2.2 大鼠牙髓干細胞的鑒定

2.2.1 細胞來源鑒定 培養(yǎng)的第3代大鼠牙髓細胞抗波形絲蛋白免疫組化染色后呈陽性表達(見圖2A);抗角蛋白染色后呈陰性表達(見圖2B)。證實所培養(yǎng)的大鼠牙髓細胞來源于間充質(zhì)組織。

A.抗波形絲蛋白染色后呈陽性表達 B.抗角蛋白染色后呈陰性表達 圖2 大鼠牙髓細胞免疫組化染色結(jié)果 (bar=161 μm)Figure 2 Immunohistochemical staining of rat dental pulp cells (bar=161 μm)

2.2.2 細胞多向分化能力檢測 成脂誘導(dǎo)后經(jīng)油紅-O染色發(fā)現(xiàn)實驗組有許多邊界清楚的小圓球狀橘紅色脂肪顆粒,部分細胞密集區(qū)顆?？蛇B接成串珠狀(見圖3A)。成骨誘導(dǎo)后經(jīng)茜素紅染色發(fā)現(xiàn)實驗組細胞紅染,細胞間可見邊界不清的紅色礦化結(jié)節(jié)(見圖3B)。經(jīng)礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)后進行ALP染色發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)組細胞漿出現(xiàn)棕黃色條索狀或團塊狀陽性著色(見圖3C)。

A.油紅-O染色 B.茜素紅染色 C.ALP染色圖3 大鼠牙髓細胞多向分化能力檢測 (bar=161 μm)Figure 3 Multidirectional differentiation ability of rat dental pulp cells (bar=161m)

2.3 細胞標(biāo)記后觀察

熒光顯微鏡下觀察可見CM-DiI染色后,大鼠牙髓干細胞的細胞漿呈現(xiàn)紅色熒光條帶,胞核未染,細胞呈現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)(見圖4A);DAPI標(biāo)記后,細胞核為藍色,細胞生長狀況良好(見圖4B)。

A.CM-DiI染色 B.DAPI染色圖4 熒光顯微鏡下觀察CM-DiI/DAPI標(biāo)記的大鼠牙髓干細胞 (bar=161 μm)Figure 4 Observation of CM-DiI/DAPI-labeled rat dental pulp stem cells under fluorescence microscopy (bar=161 μm)

2.4 CM-DiI/DAPI標(biāo)記后細胞增殖情況

兩種材料標(biāo)記后的細胞與未標(biāo)記細胞相比,在所選擇的4個時間點的OD值均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,見表1),說明CM-DiI以及DAPI標(biāo)記物對細胞增殖并未產(chǎn)生明顯影響。

表1 標(biāo)記物標(biāo)記后細胞增殖情況Table 1 Cell proliferation after marker labeling

2.5 CM-DiI/DAPI標(biāo)記后細胞LDH釋放率比較

通過比較兩種細胞標(biāo)記物標(biāo)記后12,24,48,72 h培養(yǎng)液中的LDH含量發(fā)現(xiàn),DAPI組的LDH釋放率在選取的4個測量時間點的OD值具有高于CM-DiI組的趨勢,但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖5)。

圖5 CM-DiI/DAPI標(biāo)記后LDH釋放率比較Figure 5 Comparison of LDH release rate after CM-DiI/DAPI labeling

3 討論

組織工程一直是近年來很多學(xué)者研究的熱點問題之一。自2000年Gronthos等[9]成功地將牙髓干細胞從成人恒牙中分離出來,關(guān)于牙髓干細胞如何更好地應(yīng)用于臨床治療就是很多學(xué)者關(guān)注的問題。

很多學(xué)者長時間致力于研究干細胞的分化機制,發(fā)現(xiàn)干細胞可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、血管內(nèi)皮細胞等,因此干細胞如何更好地應(yīng)用于臨床中的組織修復(fù)和組織再生是大家關(guān)注的問題[10-13]。

干細胞進行活體組織內(nèi)移植,要觀察細胞移植后在植入體內(nèi)是如何分化、遷移、存活以及體內(nèi)分布,這些都離不開細胞標(biāo)記以及示蹤技術(shù),細胞標(biāo)記效果的好壞直接影響到體內(nèi)示蹤的效果。理想的細胞標(biāo)記物應(yīng)滿足以下條件:①操作簡便,不影響所標(biāo)記細胞的生物學(xué)行為以及正常生理功能;②不影響宿主正常代謝功能;③標(biāo)記產(chǎn)物穩(wěn)定,可長時間存在于所標(biāo)記的細胞內(nèi),易觀察到細胞在宿主體內(nèi)的增殖、走行、組織分化以及體內(nèi)分布等情況;④標(biāo)記方法特異性強,靈敏度高,信號易于捕捉,易分辨產(chǎn)生新組織的來源[14-18]。目前常用的標(biāo)記方法有:Y染色體標(biāo)記、熒光染料標(biāo)記、綠色熒光蛋白標(biāo)記、分子細胞標(biāo)記、影像學(xué)成像技術(shù)標(biāo)記等。

對于不同種屬來源的細胞,標(biāo)記物可能各有不同。但是目前哪種標(biāo)記方法對間充質(zhì)來源的牙髓干細胞標(biāo)記效果更好,尚未有類似文獻報道,因此本實驗選取目前用于實驗中最具代表性的熒光染料標(biāo)記物CM-DiI和DAPI對大鼠牙髓干細胞進行體外標(biāo)記,旨在挑選出更適合大鼠牙髓干細胞的標(biāo)記物,為隨后進一步的動物實驗以及需要進行大鼠牙髓干細胞標(biāo)記以及示蹤的實驗提供理論指導(dǎo)。

本實驗通過酶解組織塊法獲得大鼠牙髓細胞,采用有限稀釋法對所培養(yǎng)的細胞進行純化,分離純化出具有克隆集落式生長的大鼠牙髓細胞。通過免疫組化證實所培養(yǎng)的細胞為間充質(zhì)來源,并且培養(yǎng)的細胞具有向脂肪細胞、成骨細胞、成牙本質(zhì)細胞分化的潛能,進一步證實所培養(yǎng)的細胞為大鼠牙髓干細胞。

CM-DiI作為一種親脂性、難溶于水的熒光染料,其易嵌入生物體的細胞膜內(nèi),并且嵌入后易在生物膜內(nèi)做側(cè)向擴散運動,進而對整個細胞膜進行標(biāo)記。根據(jù)文獻報道[19-22],該染料使用方便,在20 min左右即可使活細胞均勻著色,并且?guī)缀鯇λ鶚?biāo)記的活細胞無毒性作用,不影響細胞的存活、生長,是較為理想的細胞標(biāo)記方法。DAPI是一種可使標(biāo)記細胞的細胞核染色的熒光染料標(biāo)記物,它能與細胞核內(nèi)的DNA發(fā)生特異性結(jié)合,通過紫外光的激發(fā)可發(fā)出淺藍色熒光。DAPI可穿透活體細胞的細胞膜,對標(biāo)記的細胞無明顯細胞毒性,是理想的細胞標(biāo)記示蹤劑[23]。經(jīng)CM-DiI/DAPI標(biāo)記后的細胞,要檢測兩種不同類型的細胞標(biāo)記物對標(biāo)記后細胞的生物學(xué)影響,多通過標(biāo)記物是否會對細胞代謝功能、酶活性、細胞膜完整性等這些方面進行綜合評價、對比。LDH是一種存在于活細胞胞漿內(nèi)的糖酵解酶,當(dāng)細胞膜受損后會產(chǎn)生釋放。因此可通過檢測細胞培養(yǎng)上清液中的LDH的活性或含量,作為檢測標(biāo)記物是否會產(chǎn)生細胞毒性的敏感指標(biāo)之一[24]。本實驗中選取兩種標(biāo)記物在標(biāo)記后12,24,48,72 h這4個不同的時間點,對兩種標(biāo)記物標(biāo)記后的細胞進行細胞毒性檢測,雖然組間差異并不具有統(tǒng)計學(xué)意義,但仍提示我們DAPI較CM-DiI而言,LDH的釋放率具有增加的趨勢。

本實驗證實,CM-DiI與DAPI這兩種標(biāo)記物對大鼠牙髓干細胞進行體外標(biāo)記時,具有操作方法簡便、染色速度快、標(biāo)記率高的特點,這兩種標(biāo)記物對所標(biāo)記細胞毒性極小,但是相較DAPI而言,CM-DiI標(biāo)記后LDH的釋放率更小。因此,CM-DiI能更為有效地對大鼠牙髓干細胞進行體外標(biāo)記,是大鼠牙髓干細胞標(biāo)記與示蹤的理想試劑。但是CM-DiI這種標(biāo)記物對細胞活體內(nèi)移植后組織分化、遷移的、存活的影響有待于進一步的動物實驗所證實。