徐 肖，欒海業(yè)，楊紅燕，黃煜韜，張英虎，臧 慧，陶 紅，陳 和，陳 健，喬海龍，沈會(huì)權(quán)*

（1.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224001；2.江蘇天賦生物科技有限責(zé)任公司，江蘇 鹽城 224001）

大麥黃花葉病是由大麥黃花葉病毒（BaYMV）和大麥溫和花葉病毒（BaMMV）引起的土傳病害。大麥黃花葉病不但造成大麥減產(chǎn)，而且會(huì)降低籽粒品質(zhì)[1]。我國(guó)長(zhǎng)江中下游冬大麥產(chǎn)區(qū)是大麥黃花葉病的高發(fā)區(qū)，病田輕者減產(chǎn)30%～40%，重者顆粒無(wú)收。隨著全球氣候變暖，大麥適宜的生態(tài)區(qū)域增加，加上我國(guó)大型農(nóng)機(jī)的大面積推廣和使用，大麥黃花葉病發(fā)病面積可能進(jìn)一步增加。由于寄主和病原菌相互作用，協(xié)同進(jìn)化，不斷產(chǎn)生出新的病毒株系，導(dǎo)致我國(guó)原有抗源材料單二、蘇啤6號(hào)等優(yōu)質(zhì)啤酒大麥相繼喪失抗性[2]。因此，如何利用有效抗病基因快速選育抗大麥黃花葉病新品種，成為當(dāng)前啤酒大麥生產(chǎn)上亟待解決的重要問(wèn)題。

目前，我國(guó)大麥黃花葉病主要依靠大田或病圃進(jìn)行表型鑒定，需大量人力、物力來(lái)進(jìn)行多年多點(diǎn)多個(gè)時(shí)期的鑒定。病害發(fā)生的嚴(yán)重程度與當(dāng)年氣候條件相關(guān)，年度間的病級(jí)不穩(wěn)定，導(dǎo)致鑒定結(jié)果具有一定差異。分子標(biāo)記是在DNA水平上鑒定抗病基因，進(jìn)行抗病性選擇時(shí)不受環(huán)境影響。利用分子標(biāo)記輔助選擇（molecular marker-assisted selection，MAS）可實(shí)現(xiàn)抗病基因在品種選育中的快速應(yīng)用，有助于在生產(chǎn)上合理布局抗病基因資源和延長(zhǎng)抗病品種使用年限[3]。

我國(guó)大麥黃花葉病病毒存在6個(gè)不同的BaYMV株系（A1、A2、B1、B2、B3和B4）與1個(gè)BaMMV株系[4]，與日本的病毒株系有很高的相似度但又有所差異[5]。本研究利用InDel標(biāo)記聚合法，對(duì)180份啤酒大麥資源進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合表型鑒定，評(píng)價(jià)標(biāo)記檢測(cè)的有效性，以期為選育啤麥抗黃花葉病新品種提供廣譜性抗性資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以收集的國(guó)內(nèi)外200份啤酒大麥種質(zhì)資源為材料，其中：80份由江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，60份由揚(yáng)州大學(xué)大麥研究所提供，60份由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 田間種植

分別于2019年和2020年秋季將參試材料種植于江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南洋試驗(yàn)場(chǎng)（120.1614°E、33.3891°N）大麥黃花葉病病圃，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)材料播種1行，每行點(diǎn)播40粒，設(shè)3次重復(fù)。

1.3 表型抗性鑒定

次年2月至3月對(duì)參試材料抗病性進(jìn)行調(diào)查和鑒定，每個(gè)材料連續(xù)調(diào)查10株，每隔7 d調(diào)查1期，連續(xù)調(diào)查4期。調(diào)查時(shí)期：2020年2月20日、2月27日、3月5日與3月12日，2021年2月24日、3月3日、3月10日、3月17日。參照黃培忠等的標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行抗性級(jí)別判定：1級(jí)（高抗）—葉片葉色正常，無(wú)黃花斑點(diǎn)；2級(jí)（抗病）—葉片葉色基本正常，有黃花斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)未連成線；3級(jí)（感?。~片病斑的斑點(diǎn)連成線，葉片黃化，但植株不矮化；4級(jí)（高感）—葉片出現(xiàn)大片黃花病斑，葉片黃化，植株萎縮、矮化，趨于死亡。

1.4 分子標(biāo)記

利用InDel標(biāo)記JSB056與JSB060進(jìn)行基因型檢測(cè)，其中：JSB056與rym5緊密連鎖，JSB060與rym1緊密連鎖；2個(gè)InDel標(biāo)記均由徐婷婷等開(kāi)發(fā)[7]。引物信息見(jiàn)表1，rym1與rym5的基本信息見(jiàn)表2[8-10]。

表1 InDel標(biāo)記信息

表2 抗大麥黃花葉病基因的基本信息

1.5 自然群體基因型分析

采用CTAB法[11]提取參試材料DNA。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)鑒定參試材料基因型。PCR總體系為20 μL，包含1μL上下游引物（濃度為10μmol/L）、2 μL 10×PCR Buffer、13.4μL ddH2O、2μL MgCl2(Mg2+20 mmol/L)、0.4μL DNTPs（濃度為10μmol/L）、0.2 μLTaq酶（濃度為2.5 U/μL）、模板DNA 1μL（濃度為50 ng/μL）。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃5 min；變性94℃45 s，退火55℃45 s，延伸72℃45 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；再延伸72℃10 min，12℃保存?zhèn)溆?。以瓊脂糖凝膠（2%）上電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色，在凝膠成像儀照相、記錄，以木石港3號(hào)為對(duì)照，其帶型記為“A”，其余帶型記為“B”，進(jìn)行基因型分型統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然群體的黃花葉病抗性

取每年度4個(gè)時(shí)期發(fā)病病級(jí)最高值作為本年度自然群體200份啤酒大麥種質(zhì)資源黃花葉病抗性鑒定結(jié)果，2年數(shù)據(jù)表明，均表現(xiàn)為抗病的有37份材料，均表現(xiàn)為感病的有143份材料，20份在年份間表現(xiàn)不穩(wěn)定的材料予以剔除。用于基因型鑒定的啤酒大麥種質(zhì)資源共180份，啤酒大麥名稱及表型抗性信息見(jiàn)表3。

2.2 分子標(biāo)記鑒定及其準(zhǔn)確性

以木石港3號(hào)為對(duì)照，利用InDel標(biāo)記JSB056與JSB060對(duì)180份啤酒大麥進(jìn)行基因型鑒定，即與木石港3號(hào)帶型一致為抗性材料，其余均為感病材料。結(jié)果分析表明，JSB056與JSB060的基因型與表現(xiàn)型符合率分別為80.6%和77.8%。由表3可知，聚合2個(gè)標(biāo)記，抗病種質(zhì)的檢測(cè)率（檢測(cè)率=JSB056與JSB060均為抗病基因型材料數(shù)/抗病表現(xiàn)型材料數(shù)×100%）為91.9%。

表3 180份啤酒大麥名稱及大麥黃花葉病表型抗性信息

JSB056是rym5的連鎖分子標(biāo)記，JSB060是rym1的連鎖分子標(biāo)記。單純利用JSB056與JSB060均可在自然群體中鑒定大麥黃花葉病抗病材料，但檢測(cè)效率不高。聚合2個(gè)標(biāo)記，可使檢測(cè)率高達(dá)91.9%。由于rym5與rym1是國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較多的大麥黃花葉病抗性基因，對(duì)我國(guó)大麥黃花葉病病毒株系具有一定的抗性，因此聚合使用JSB056與JSB060對(duì)抗大麥黃花葉病材料檢測(cè)效果較好，可用于大麥抗黃花葉病的分子輔助選擇育種。

標(biāo)記JSB056的PCR擴(kuò)增帶型見(jiàn)圖1，擴(kuò)增帶型清晰度較高，無(wú)雜帶，進(jìn)一步說(shuō)明了InDel標(biāo)記穩(wěn)定性強(qiáng)。

圖1 InDel標(biāo)記JSB056在部分啤酒大麥資源中的檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

迄今，已報(bào)道出21個(gè)正式命名的大麥黃花葉病抗性基因，隨著大麥黃花葉病病毒生理小種的不斷變異，如單二等生產(chǎn)上大面積種植的品種大麥黃花葉病抗性也逐漸喪失。聚合不同抗病基因至同一品種中，提高品種抗性的同時(shí)，也能延長(zhǎng)其使用年限，是解決生產(chǎn)上抗病問(wèn)題的有效措施[12]。目前，國(guó)內(nèi)外已獲得大量與抗大麥黃花葉病相關(guān)的分子標(biāo)記，除少數(shù)克隆基因已經(jīng)獲得共分離標(biāo)記外，其他分子標(biāo)記是在特定的遺傳背景下基于特定的遺傳群體進(jìn)行定位而獲得的，在應(yīng)用于抗病性育種時(shí)需要使用不同遺傳背景的分離群體來(lái)驗(yàn)證其緊密連鎖分子標(biāo)記的有效性。

DNA分子標(biāo)記鑒定方法不受環(huán)境因素、植物不同發(fā)育階段不平衡等影響。最普遍用于大麥品種鑒定的DNA分子標(biāo)記為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）。王艷平等利用28個(gè)SSR引物對(duì)29份大麥資源進(jìn)行基因型檢測(cè)，將不同穗棱型品種聚為一類[13]。朱彩梅等利用50個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)76份糯大麥進(jìn)行聚類，結(jié)果表明種群劃分與皮裸性和地理分布有關(guān)[14]。張利莎等將SSR標(biāo)記與EST技術(shù)相結(jié)合，定性檢測(cè)了4種大麥麥芽混合后混雜度高于10%的麥芽樣品；利用SNP標(biāo)記與KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR）技術(shù)相結(jié)合，鑒定了混雜度低至5%的麥芽樣品[15]。Pattemore等利用45個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)大麥品種進(jìn)行基因分型,生成了每個(gè)參試材料SNP標(biāo)記獨(dú)特的條形碼[16]。徐東東等利用SNP標(biāo)記進(jìn)行麥芽品質(zhì)分析，有效地鑒定了品種真實(shí)性及麥芽純度[17]。

SSR與SNP作為最常使用的分子標(biāo)記，SSR分子標(biāo)記具有共顯性與穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，且標(biāo)記成本低，應(yīng)用技術(shù)簡(jiǎn)單。SSR標(biāo)記的缺點(diǎn)是在基因型鑒定過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)帶型雜亂、模糊或帶型丟失等現(xiàn)象，導(dǎo)致基因型錯(cuò)誤判別的概率增加。SNP分子標(biāo)記分布廣泛、數(shù)量眾多，且是二態(tài)性分子標(biāo)記，其具有檢測(cè)速度快、自動(dòng)化水平較高等優(yōu)點(diǎn)，但由于大麥基因組序列較大，使得開(kāi)發(fā)出的SNP分子標(biāo)記在利用過(guò)程中需要花費(fèi)大量人力物力，導(dǎo)致成本較高。二態(tài)性InDel標(biāo)記具有共顯性、穩(wěn)定性高與多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)及瓊脂糖凝膠電泳即可進(jìn)行基因分型，且擴(kuò)增帶型清晰度與準(zhǔn)確性很高。

rym5與rym1是全球應(yīng)用較多的大麥黃花葉病抗性基因，本研究表明利用InDel標(biāo)記鑒定大麥黃花葉病抗性可獲得理想的篩選效果。為獲得更高的分子標(biāo)記選擇效率，還需進(jìn)一步定位新的抗病基因，開(kāi)發(fā)出與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，從而篩選出聚合多個(gè)抗病基因的抗源，培育出抗黃花葉病啤酒大麥新品種。