肖蘭飛高繼萍閆曉如王曉堂續(xù)國強(qiáng)宋國華

(1.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬精神衛(wèi)生醫(yī)院,太原 030001)

口腔癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,死亡率高,預(yù)后差[1]。 盡管口腔癌的預(yù)后和治療取得了很大的進(jìn)展,但其 5 年生存率仍低于 63%[2]。 因此,尋找療效確切的抗口腔癌藥物,可能成為提高口腔癌治愈率的重要研究方向。 近年來,已有研究表明傳統(tǒng)中醫(yī)藥在腫瘤治療中發(fā)揮著重要的作用[3]。 槲皮素是廣泛存在于我們?nèi)粘ｏ嬍持幸环N植源性黃酮類化合物,它通過促凋亡作用和抑制多種癌癥的發(fā)生發(fā)展顯示出抗癌潛能[4]。 研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可通過線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路誘導(dǎo)人口腔癌SAS 細(xì)胞凋亡[5]。 也有研究表明,槲皮素在體外實(shí)驗(yàn)可有效抑制口腔癌SCC-25 細(xì)胞生長、遷移和侵襲,其分子機(jī)制是通過細(xì)胞周期阻滯和線粒體介導(dǎo)的凋亡實(shí)現(xiàn)的[6]。 PI3K/AKT 與癌細(xì)胞增殖和凋亡、周期調(diào)控、侵襲轉(zhuǎn)移以及化放療抗拒密切相關(guān),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[6-8]。 目前尚無PI3K/AKT 信號(hào)通路在槲皮素對(duì)口腔癌細(xì)胞生物學(xué)行為中作用的研究。 因此,本研究探討了槲皮素對(duì)口腔癌Tca-8113 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲功能的影響及對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路的調(diào)控作用,旨在為口腔癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)所使用的人口腔癌細(xì)胞系Tca-8113 購自武漢博士德生物公司。

1.2 主要試劑與儀器

槲皮素購自上海Acmec 公司;CCK-8 試劑盒購自上海翊圣公司;Transwell 小室與Matrigel 基底膜基質(zhì)均購自美國Corning 公司;TRIzol、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)與TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)均購自日本TaKaRa 公司;RIPA 增強(qiáng)型裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒均購自武漢博士德生物公司;anti-PTEN、anti-AKT 和 anti-FOXO1 一抗均購自 Proteintech 公司; anti-p-AKT 和 anti-p-FOXO1 購 自 Wanleibio 公 司;anti-BCL2L11 和 βactin 均購自美國CST 公司,貨號(hào)分別為:22034-1-AP、10176-2-AP、18592-1-AP、WLP001a、WL03634、2933、4970 T。 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自日本 Sanyo 公司;微孔分光光度計(jì)Epoch 購自美國Bio-tek 公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀Step One Plus 購自美國ABI公司;普通PCR 儀和蛋白垂直電泳儀購自美國Bio-Rad 公司;化學(xué)發(fā)光成像儀購自英國Yngene 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞系的選擇

選用3 種不同分化類型的口腔癌細(xì)胞系進(jìn)行了槲皮素處理預(yù)實(shí)驗(yàn)。 與其余兩種細(xì)胞系相比,Tca-8113 作為一種低分化的口腔癌細(xì)胞系,其對(duì)于槲皮素的處理更加敏感,因此我們選用Tca-8113 作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 此外,Tca-8113 作為經(jīng)典的細(xì)胞系也在口腔癌研究中被廣泛應(yīng)用[9]。

1.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

將Tca-8113 細(xì)胞培養(yǎng)在添加有10%胎牛血清,100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度為37℃,二氧化碳含量為5%。 將細(xì)胞分為對(duì)照組和槲皮素處理組,槲皮素處理組細(xì)胞依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,選擇槲皮素的最佳作用濃度為50 μmol/L[10],不做任何處理的細(xì)胞(即0 μmol/L 槲皮素)作為對(duì)照組。

1.3.3 細(xì)胞增殖檢測

胰酶消化細(xì)胞后,調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×104/mL。用移液器吸取100 μL 細(xì)胞懸液加入96 孔板中,藥物處理24、48、72 h,每組設(shè)置 5 個(gè)復(fù)孔。 處理結(jié)束后每孔加入CCK-8 溶液10 μL 后置于37℃培養(yǎng)箱孵育 2 h。 酶標(biāo)儀檢測 450 nm 光吸收度(optical density, OD),細(xì)胞增殖能力根據(jù)下述公式計(jì)算:細(xì)胞增殖能力=[(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100%。

1.3.4 Transwell(添加基質(zhì)膠)檢測細(xì)胞的遷移(侵襲)能力

用PBS 洗滌兩次經(jīng)處理的細(xì)胞,胰蛋白酶消化離心后用不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為 5×103/mL。 用移液器移取 200 μL 細(xì)胞懸液加入 Transwell 小室中,700 μL 含有 10% FBS 的培養(yǎng)基加入24 孔板中,共培養(yǎng)24 h。 培養(yǎng)結(jié)束后,用棉簽從小室中除去未遷移的細(xì)胞,PBS 洗滌一次,4%多聚甲醛固定30 min,隨后0.1%結(jié)晶紫染液染色15~30 min,PBS 緩慢輕柔的洗滌一次。 每個(gè)小室隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.5 qRT-PCR 檢測相關(guān)mRNA 表達(dá)情況

將培養(yǎng)在六孔板中藥物處理后的細(xì)胞加入TRIzol 裂解,裂解完成后提取總RNA,測定濃度與純度后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,最后取反轉(zhuǎn)錄完成的 cDNA 進(jìn)行 qRTPCR 反應(yīng),以GAPDH作為內(nèi)參。 引物序列見表1。

表1 各基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.3.6 Western blot 檢測處理前后相關(guān)蛋白表達(dá)情況

將培養(yǎng)在六孔板中藥物處理后的細(xì)胞加入RIPA裂解,裂解完成后離心取上清,使用BCA 試劑盒檢測每組細(xì)胞的蛋白濃度,每組取15 μg 蛋白進(jìn)行SDSPAGE 凝膠電泳,電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至NC 膜,封閉液封閉后加入一抗于4℃孵育過夜,一抗孵育結(jié)束后二抗室溫孵育1 h,然后在曝光儀中進(jìn)行曝光,Image J分析蛋白的表達(dá)量,以β-actin 作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示結(jié)果。 采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間比較,以P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素可抑制口腔癌細(xì)胞的生長

圖1 結(jié)果顯示,在槲皮素剛作用于Tca-8113 細(xì)胞系時(shí),對(duì)照組與槲皮素組具有相似的細(xì)胞增殖能力;給藥后24 h 細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組出現(xiàn)下降,直到 48 h 達(dá)到最低(P<0.01)。 給藥后 72 h,細(xì)胞增殖能力出現(xiàn)一定上升,但與48 h 相比沒有差異(P>0.05),這種現(xiàn)象可能是與隨著藥物作用時(shí)間的增加藥效出現(xiàn)降低有關(guān)。 從以上數(shù)據(jù)可以得出,槲皮素對(duì)Tca-8113 的增殖可能具有抑制作用,且在48 h 時(shí)效果較好,所以據(jù)此選用處理48 h 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用時(shí)間。

圖1 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測槲皮素對(duì)Tca-8113 細(xì)胞增殖的影響Figure 1 CCK-8 assay was used to detect the effect of quercetin on Tca-8113 cell proliferation

2.2 槲皮素可抑制口腔癌細(xì)胞遷移和侵襲

圖2A 顯示,與對(duì)照組相比,槲皮素處理組Tca-8113 細(xì)胞遷移的數(shù)目減少,說明細(xì)胞的遷移能力顯著降低(P<0.001);圖2B 侵襲結(jié)果顯示,槲皮素處理組Tca-8113 細(xì)胞侵襲的數(shù)目也出現(xiàn)下降,說明槲皮素也抑制細(xì)胞的侵襲能力(P<0.001),此結(jié)果表明槲皮素可以抑制Tca-8113 細(xì)胞的遷移與侵襲。

圖2 Transwell(添加基質(zhì)膠)檢測Tca-8113 細(xì)胞的遷移(侵襲)能力Note. A, Transwell assay was used to detect the migration cell number and its statistics of Tca-8113. B, Transwell assay was used to detect the invasion cell number and its statistics of Tca-8113. Compared with control,***P<0.001.Figure 2 Transwell (add matrigel) to detect migration (invasion) ability of Tca-8113 cell

2.3 槲皮素處理前后細(xì)胞 PTEN、AKT、FOXO1、BCL2L11 的表達(dá)

如圖3A 結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,槲皮素處理組PTEN和BCL2L11 mRNA 表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05),但AKT和FOXO1 mRNA 表達(dá)水平無顯著差異。 圖3B 和3C 結(jié)果顯示槲皮素處理組PTEN和BCL2L11 蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05),FOXO1 和AKT 磷酸化水平顯著下調(diào)(P<0.01)。

圖 3 PTEN、AKT、FOXO1、BCL2L11 在 Tca-8113 各組細(xì)胞中的表達(dá)Note. A, The Tca-8113 cell mRNA expression of PTEN、AKT、FOXO1、BCL2L11 determined by qRT-PCR. B, The Tca-8113 cell potein expression of PTEN、AKT、p-AKT、FOXO1、p-FOXO1、BCL2L11 determined by Western blot. C, Statistical analysis of protein expression.Compared with control,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.Figure 3 Expression of PTEN、AKT、FOXO1、BCL2L11 in Tca-8113 cell

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔癌中最為常見的一種類型,由于其發(fā)病部位位于口腔,通過外科手術(shù)切除病變會(huì)嚴(yán)重影響患者的美觀,所以亟需一種合理的治療方式[11]。 槲皮素是研究較多的一種中藥單體,具有抗癌的潛力,已成為一種潛在的抗癌治療劑[12]。 槲皮素被認(rèn)為可以誘導(dǎo)包括口腔癌細(xì)胞在內(nèi)的許多癌細(xì)胞的生長抑制和細(xì)胞死亡[5,10]。 本研究通過探討槲皮素對(duì)口腔癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,發(fā)現(xiàn)槲皮素可以顯著抑制Tca-8113細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲,以上研究與以往研究結(jié)果一致。

PTEN作為 PI3K/AKT 信號(hào)通路重要調(diào)控因子,是PI3K/AKT 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控蛋白,能夠抑制PIP3 去磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)镻IP2,進(jìn)而抑制AKT及其下游分子活化,阻止PI3K/AKT 通路激活[13-14]。 已有文獻(xiàn)表明槲皮素可以調(diào)控PTEN的表達(dá)以及調(diào)控PI3K/AKT 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7,15]。 本研究利用qRT-PCR 和 Western blot 檢測了PTEN和AKTmRNA 和蛋白水平表達(dá),結(jié)果顯示在槲皮素處理組中,口腔癌Tca-8113 細(xì)胞中PTENmRNA 和蛋白表達(dá)均上調(diào),相反,AKT磷酸化水平顯著下調(diào)。

FOXO1 屬于叉形頭轉(zhuǎn)錄因子的O 亞型,充當(dāng)腫瘤抑制因子,調(diào)節(jié)許多涉及凋亡反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化和細(xì)胞代謝的生物學(xué)過程[16]。 作為主轉(zhuǎn)錄因子,FOXO1 通過PI3K/AKT 信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié),然后活化的AKT 促使FOXO1 S256 位點(diǎn)處磷酸化(p-FOXO1),從而驅(qū)動(dòng)自身與14-3-3 二聚體結(jié)合,最后FOXO1 從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)[17-18]。 本研究結(jié)果顯示,槲皮素處理組中,FOXO1 在mRNA水平上無顯著差異,但FOXO1 磷酸化水平顯著降低,與 AKT 表達(dá)相一致。BCL2L11 是BCL2 家族近年來頗受關(guān)注的一個(gè)含有BH3 結(jié)構(gòu)域的成員,該結(jié)構(gòu)域?qū)Υ龠M(jìn)凋亡有重要作用,在許多抗腫瘤藥物引起的腫瘤細(xì)胞凋亡中都觀察到BCL2L11 表達(dá)的升高[19]。 有研究表明磷酸化FOXO1 負(fù)調(diào)控BCL2L11的表達(dá),當(dāng)位于BCL2L11 啟動(dòng)子附近的兩個(gè)保守的FOXO1 結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變以防止FOXO1 結(jié)合時(shí),這一點(diǎn)就基本消失了,證明了BCL2L11 基因是FOXO1 直接的靶標(biāo)[20-22]。 本研究結(jié)果顯示槲皮素處理組BCL2L11 mRNA 和蛋白水平表達(dá)均顯著上調(diào)。 這提示我們槲皮素對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路具有負(fù)調(diào)控作用。

綜上所述,槲皮素可抑制口腔癌Tca-8113 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,其機(jī)制可能是通過上調(diào)PTEN的表達(dá),負(fù)調(diào)控PI3K/AKT 通路減弱FOXO1的磷酸化水平,進(jìn)而引起B(yǎng)CL2L11 的表達(dá)增加實(shí)現(xiàn)的。