張叢敏朱曉靜魏金鎧李紅亞李彩霞唐 卉靳晨晨趙永才

(保定市第一中心醫(yī)院兒科,河北保定 071000)

神曲消食口服液是一種純中藥制劑,是著名兒科專家方鶴松教授研制出的臨床驗(yàn)方,對(duì)兒童脾胃功能虛弱和飲食積滯導(dǎo)致的厭食、食欲不振及食量減少等有獨(dú)特的藥效[1]。 小兒功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是臨床具有上腹痛、惡心、嘔吐及脹氣等癥狀,但排除器質(zhì)性疾病的綜合征,其病情多反復(fù)、遷延,嚴(yán)重影響患兒身心健康[2]。目前,臨床治療常以經(jīng)驗(yàn)性治療為主,西藥治療后往往會(huì)出現(xiàn)口苦、咽干等不良反應(yīng),導(dǎo)致患兒依從性較差,影響治療效果[3]。 趙詠梅等[4]研究指出,神曲消食口服液對(duì)兒童功能性消化有較好的臨床效果,可明顯提高胃排空能力。 但神曲消食口服液制劑成分復(fù)雜,其安全性評(píng)價(jià)和具體作用機(jī)制的研究較少。 故本研究將觀察神曲消食口服液對(duì)正常KM 小鼠血常規(guī)及肝腎功能的影響,并構(gòu)建FD 模型小鼠,探究神曲消食口服液對(duì)FD 小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)能力的影響,并初步分析其作用機(jī)制,旨在為神曲消食口服液的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

95 只清潔級(jí) KM 小鼠,雄性,6~8 周齡,28~32 g,購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(冀)2019-0010],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心開(kāi)展[SYXK(冀)2019-0001]。 飼養(yǎng)環(huán)境:21℃ ~25℃恒溫,相對(duì)濕度45% ~ 65%,晝夜明暗交替時(shí)間為12 h,各項(xiàng)操作符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的“3R”原則,經(jīng)保定市第一中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)([2018]004 號(hào))。

1.2 主要試劑與儀器

神曲消食口服液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇龍鳳堂中藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20153035,規(guī)格10 mL×6支,批號(hào):201806);左旋精氨酸購(gòu)自上?，庬嵣锟萍加邢薰?批號(hào):180109;肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京利德曼生化股份有限公司;引物合成由上海茁彩生物科技有限公司提供;蛋白一抗及二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。 血常規(guī)分析儀購(gòu)自日本光電工業(yè)株式會(huì)社,型號(hào)為6318K;全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司,型號(hào)為 UniCal DxC800;熒光PCR 儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司,型號(hào)為CFX96。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

40 只KM 小鼠隨機(jī)分為正常組、神曲消食口服液低、中及高劑量組,每組10 只,神曲消食口服液組分別灌胃0.1、0.2 及0.3 mL 神曲消食口服液(分別混以 0.2、0.1 及 0 mL 生理鹽水),每天 1 次,連續(xù)灌胃30 d,正常組以同體積生理鹽水替代。

1.3.2 血常規(guī)及肝腎功能檢測(cè)

取血后,經(jīng)血常規(guī)分析儀和全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè),血常規(guī)指標(biāo)有:白細(xì)胞(white blood cells,WBC)、紅細(xì)胞(red blood cells,RBC)、血紅蛋白(hemoglobin,HGB)、血小板(platelet,PLT)、淋巴細(xì)胞 ( lymphocyte, LYM)、 單 核 細(xì) 胞 ( monocytes,MONO)及中性粒細(xì)胞(neutrophil,NEU),肝腎功能指標(biāo)有: 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、總膽汁酸(total bile acid,TBA)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)及肌酐(creatinine,CRE)。

1.3.3 模型建立及給藥

從55 只KM 小鼠中隨機(jī)選出10 只作為正常組,剩余小鼠采用不規(guī)律進(jìn)食+左旋精氨酸(L-Arg)法構(gòu)建FD 動(dòng)物模型,具體方法[5]:以2 d 進(jìn)食,1 d禁食為一個(gè)循環(huán)單位,循環(huán)10 d;第11 天和第12 天時(shí)腹腔注射0.1 g/kgL-Arg;正常組小鼠正常進(jìn)食,腹腔注射以同體積生理鹽水替代。 造模結(jié)束后隨機(jī)選取5 只小鼠處死,檢測(cè)其胃排空率及小腸推進(jìn)率降低,則判斷FD 模型復(fù)制成功,再將剩余40 只模型小鼠隨機(jī)分為模型組、神曲消食口服液低、中及高劑量組,每組10 只;神曲消食口服液組分別灌胃0.1、0.2 及0.3 mL 神曲消食口服液(分別混以0.2、0.1 及 0 mL 生理鹽水),每天 1 次,連續(xù)灌胃 14 d;正常組和模型組以同體積生理鹽水替代,觀察各組小鼠體重的變化。

1.3.4 胃排空及腸推進(jìn)功能檢測(cè)

末次給藥后禁食24 h,每只0.5 g 的碳末半固體糊(5 g 羧甲基纖維素、8 g 奶粉、4 g 糖、4 g 淀粉及1 g 活性炭混于128 mL 水)灌胃;處死小鼠,取胃組織稱重,計(jì)為胃全重;剪開(kāi)胃組織清除胃內(nèi)容物后稱量,計(jì)為胃凈重;胃排空率=[1-(胃全重-胃凈重)/固體糊狀物重]×100%;取出完整小腸組織(胃部幽門切跡至碳糊最前端),測(cè)量其全長(zhǎng),小腸推進(jìn)率=(胃部幽門切跡至碳糊最前端的距離/小腸全長(zhǎng))×100%。

1.3.5 HE 染色

將胃組織固定于4%多聚甲醛溶液中過(guò)夜,經(jīng)常規(guī)HE 染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察胃組織病理學(xué)改變,并拍照。

1.3.6 qRT-PCR 檢測(cè)

取適量小鼠胃組織,加入液氮研磨成粉末;加入適量RNAiso Plus,冰上靜置6 min,以12000 r/min離心6 min;以氯仿-異丙醇體系,提取總RNA;純度分析后,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),合成cDNA 模板;加入SYBR Premix 進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(cè),參數(shù)設(shè)置:95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 60 s,72℃ 1 min,共 39個(gè) 循 環(huán)。 GAPDH 上 游 引 物 5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′, 下 游 引 物 5 ′ -TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′; 肌 醇 需 求 酶 1(Inositol requirement enzyme 1,IREl) 上游引物 5′-GGAGACCCTACGCTATTTGACCT-3′, 下 游 引 物 5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′;腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 2 ( Tumor necrosis factor receptorassociated factor 2, TRAF2 ) 上 游 引 物 5′-CGCGGATCCATGGCTGCAGCTAGCGTG-3′, 下 游 引物 5′-CGCTCTAGATTAGAGCCCTGTCAGGTCCTRA-3′[6]。 按照 2-△△CT法,以 GADPH 為內(nèi)參,計(jì)算 IREl和TRAF2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 Western blot 檢測(cè)

取適量小鼠胃組織,加入液氮研磨成粉末;加入適量RIPA 裂解液,冰上勻漿40 min,以12000 r/min 離心 10 min,提取胃組織總蛋白;取 50 μg 上樣,進(jìn)行恒壓電泳(80 V~110 V);再300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜后,室溫下封閉1 h;4℃下蛋白一抗過(guò)夜,β-actin稀釋比為 1 ∶1000,IREl 稀釋比為 1 ∶500,TRAF2 稀釋比為1 ∶500;室溫下蛋白二抗孵育30 min,稀釋比為1 ∶10000;調(diào)整曝光條件,暗室中進(jìn)行顯影、定影;掃描膠片,經(jīng)Image J 軟件灰度分析后,以β-actin 為內(nèi)參,計(jì)算胃組織中IREl 和TRAF2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t法,以P<0.05 表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血常規(guī)情況

各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較,組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示神曲消食口服液給藥對(duì)小鼠血常規(guī)各指標(biāo)無(wú)影響,見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)的比較(n=10)Table 1 Comparison of blood routine indexes among all groups

2.2 肝腎功能情況

各組小鼠肝腎功能指標(biāo)比較,組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示神曲消食口服液給藥對(duì)小鼠肝腎功能指標(biāo)無(wú)影響,見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肝腎功能指標(biāo)的比較(n=10,U/L)Table 2 Comparison of liver and kidney function indexes among all groups

2.3 一般情況及體重變化的比較

造模初期(1 周內(nèi)),各組小鼠發(fā)育良好,活動(dòng)度高。 造模1 周之后,模型組小鼠逐漸出現(xiàn)靠邊扎堆、活動(dòng)度降低,毛發(fā)雜亂失去光澤,體重降低,但神曲消食口服液組小鼠上述表現(xiàn)較輕。 造模結(jié)束時(shí),與正常組比較,其他組別小鼠體重增長(zhǎng)更緩慢(P<0.05);干預(yù)結(jié)束時(shí),與正常組比較,其他組別小鼠體重增長(zhǎng)更緩慢(P<0.05),但與模型組比較,神曲消食口服液高劑量組體重增長(zhǎng)加快(P<0.05),提示神曲消食口服液給藥可促進(jìn)小鼠體重增長(zhǎng),提高其活動(dòng)度,見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠增長(zhǎng)體重的比較(n=10,g)Table 3 Comparison of weight gain among all groups

2.4 胃組織病理學(xué)觀察

如圖1 各組小鼠胃組織粘膜層、粘膜下層、肌層及漿膜層結(jié)構(gòu)清晰,均未見(jiàn)明顯的病理學(xué)改變,符合功能性消化不良動(dòng)物模型的要求。

圖1 胃組織病理學(xué)觀察Note. A, Normal group. B, Model group. C, Low-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. D, Medium-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. E, High-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group.Figure 1 Pathological observation of gastric tissues

2.5 小鼠胃排空及腸推進(jìn)功能

與正常組相比,模型組小鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率明顯降低(P<0.05);與模型組相比,神曲消食口服液低、中及高劑量組胃排空率和小腸推進(jìn)率明顯升高(P<0.05),提示神曲消食口服液給藥可促進(jìn)小鼠胃排空和小腸推進(jìn)功能,見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠胃排空及腸推進(jìn)功能的比較(n=10,%)Table 4 Comparison of gastric emptying and intestinal propulsion function among all groups

2.6 胃組織IREl 和TRAF2 表達(dá)情況

與正常組相比,模型組IREl 和TRAF2 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯上升(P<0.05);與模型組相比,神曲消食口服液低、中及高劑量組IREl 和TRAF2 mRNA 和蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.05),提示神曲消食口服液給藥可抑制小鼠IREl、TRAF2 mRNA 和蛋白的表達(dá),從而改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,見(jiàn)圖2、表5。

表5 各組小鼠胃組織IREl 和TRAF2 表達(dá)的比較(n=10)Table 5 Comparison on the expression of IRE1 and TRAF2 proteins in gastric tissues among all groups

圖2 各組小鼠胃組織IREl 和TRAF2 蛋白表達(dá)情況Note. A, Normal group. B, Model group. C, Low-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. D, Medium-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. E,High-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group.Figure 2 Expression of IRE1 and TRAF2 proteins in gastric tissues of each group

3 討論

中醫(yī)學(xué)中無(wú)“消化不良”的概念,結(jié)合臨床表現(xiàn),可歸于“痞滿”的范疇,因其“脾常不足”的生理特點(diǎn),多表現(xiàn)為脾胃虛弱證[7]。 而神曲消食口服液具有健胃消食、健脾理氣的功效,其主要藥物有焦山楂、焦神曲、焦麥芽、黨參、白術(shù)、茯苓、白芍、木香、醋延胡索、砂仁、甘草。 方中焦山楂、焦神曲、焦麥芽可消食導(dǎo)滯,黨參、白術(shù)、茯苓、白芍可健脾益氣,木香、醋延胡索、砂仁可健胃止痛,甘草則起調(diào)和諸藥之效[8]。 臨床研究結(jié)果顯示,神曲消食口服液具有提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能的作用,可上調(diào)血清HGB[9]。 但本研究結(jié)果顯示,神曲消食口服液對(duì)RBC 及HGB 水平無(wú)明顯影響,可能原因有:(1)KM 小鼠體內(nèi)環(huán)境與人體具有差異性;(2)作用時(shí)間較短。

肝是人體酶含量最豐富的器官,當(dāng)肝受到損傷,組織細(xì)胞內(nèi)酶類會(huì)進(jìn)入外周血液中,導(dǎo)致血清中酶活性的異常升高,常用于肝功能檢查的指標(biāo)主要有 ALT、AST 和 TBA 等[10]。 腎是重要的排泄器官,能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)水電平衡、酸堿平衡。 BUN、CREA是臨床常見(jiàn)的腎功能檢測(cè)指標(biāo),在一定程度上可反映腎小球?yàn)V過(guò)功能[11]。 本研究結(jié)果顯示,神曲消食口服液對(duì)正常小鼠上述肝腎功能指標(biāo)均無(wú)明顯影響,提示神曲消食口服液安全性較高。

本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率明顯降低,說(shuō)明建模后小鼠出現(xiàn)明顯胃腸動(dòng)力障礙,且小鼠胃組織未出現(xiàn)明顯病理改變,但伴有體重降低、活躍度降低及情緒暴躁易怒,提示FD 造模成功。 經(jīng)神曲消食口服液處理后,FD 小鼠體重增長(zhǎng)加快,胃排空率和小腸推進(jìn)率明顯升高,提示神曲消食口服液可明顯改善FD小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)能力,與文獻(xiàn)報(bào)道相符[12]。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在FD 中有重要的作用[13]。 機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,引起IREl 與GRP78 的分離,激活 IREl 的核酸內(nèi)切酶活性,招募接頭分子TRAF2,引起細(xì)胞自噬或凋亡等其他變化,最終導(dǎo)致FD[14-15]。 本研究顯示,與正常組比較,模型組胃組織中IREl 和TRAF2 mRNA 和蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),說(shuō)明FD 小鼠IREl 信號(hào)通路異常激活;但經(jīng)神曲消食口服液處理后,IREl 和TRAF2 mRNA 和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),提示神曲消食口服液可能通過(guò)抑制IREl 和TRAF2 表達(dá),改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而提高胃腸道細(xì)胞活力,最終起到治療FD 的作用。

綜上所述,神曲消食口服液具有較好的安全性,且對(duì)FD 小鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)有明顯促進(jìn)作用,可能與下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)因子IREl 和TRAF2 的表達(dá),改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。 同時(shí)在神曲消食口服液低、中、高劑量三組中,高劑量作用效果最強(qiáng),提示中藥在用量上亦存在量效關(guān)系,但仍需要采用不同的建模方法,選用不同的動(dòng)物載體,作進(jìn)一步驗(yàn)證。