周倩揚楊慧敏李 靜徐 娜劉繼鑫張蓓蓓于 倩鄭葵陽顏 超*

(1.徐州醫(yī)科大學病原生物學與免疫學教研室,江蘇徐州 221004;2.江蘇省免疫與代謝重點實驗室,江蘇徐州 221004)

原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)是一種慢性膽汁淤積性肝病,其主要表現(xiàn)為膽管周圍炎癥和纖維化,可造成膽管阻塞、肝硬化、肝衰竭甚至膽管癌[1-3]。 遺傳、環(huán)境、機體免疫等因素均可導致PSC 的發(fā)生,但PSC 的致病機制尚不完全清楚,目前尚無有效的治療藥物[4]。因此,尋找一種有效改善或治療PSC 的藥物,迫在眉睫。

DDC(3,5-diethoxycarbonyl L 1,4-dihydrocollidine,DDC)是一種異源性毒物,小鼠經(jīng)喂飼DDC 后,可致膽管內栓塞,最終形成膽管阻塞型膽汁淤積性肝損傷,其在臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制上與PSC 有諸多的相似之處,因此DDC 誘導的小鼠膽管損傷是研究PSC 致病機制和相關藥物研發(fā)較為理想的動物模型[5]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin,mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在體內有mTORC1 和mTORC2 兩種功能不同的復合體,廣泛參與細胞的增殖、生長和自噬等生物學過程,雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一種有效且特異性的mTORC 抑制劑[6]。 有研究表明,雷帕霉素可減輕ConA 誘導的肝細胞壞死、炎細胞浸潤及肝纖維化[7]。 因此,本研究擬研究雷帕霉素對DDC 飲食誘導的膽管損傷是否具有治療作用,并探討其潛在的作用機制,為臨床治療原發(fā)性硬化性膽管炎提供潛在藥物。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級C57BL/6 雌性小鼠15 只,6~8 周,體重18~25 g,購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(浙)2019-0001],飼養(yǎng)于清潔級動物房,自由攝食和飲水,腹腔注射等操作在徐州醫(yī)科大學實驗動物中心屏障動物實驗操作間[SYXK(蘇)2016-0028]進行,實驗動物使用、操作許可由徐州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準通過(IACUC:(201801w003)),動物護理和本研究的所有實驗都遵循國家實驗室動物中心和徐州醫(yī)科大學實驗動物中心的指導方針,并按實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

DDC(STBJ2468,純度99%,美國 Sigma 公司);雷帕霉素(上海碧云天公司); TRIzol (美國Invitrogen 公司); 引物由上海捷瑞公司合成;FastKing 一步法除基因組cDNA 第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司);實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)熒光Mix(北京TransGen Biotech公司);兔抗小鼠 CK19,Ki67 抗體(美國 Abcam 公司); 兔 抗 小 鼠 mTOR, P-mTOR, AKT, P-AKT(Ser473)單克隆抗體(杭州華安生物技術有限公司);兔抗小鼠p65,P-p65 單克隆抗體(美國,Cell Signaling Technology 公司);兔抗小鼠 GAPDH 單克隆抗體、山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗(武漢ABclonal公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組與模型的建立

8 周齡清潔級雌性C57BL/6J 小鼠平均體重20 g 左右,隨機分為單獨 DDC 飲食組、DDC 造模+雷帕霉素(RAPA)治療組,每組5 只小鼠。 治療組每天腹腔注射一次雷帕霉素(根據(jù)說明書,用DMSO 溶藥,用生理鹽水稀釋至1 mg/mL,注射劑量為5 mg/kg 小鼠體重),兩組均連續(xù)注射一周,此期間每天對照組腹腔注射0.1%二甲基亞砜(DMSO),最后一次注射 RAPA 后 24 h 進行取材及相關的檢測,見圖1a。

1.3.2 HE 染色

小鼠肝組織于4%中性甲醛中固定約48 h 后經(jīng)脫水、石蠟包埋制成組織石蠟切片,行蘇木素& 伊紅(HE)及Masson 染色,于光學顯微鏡下觀察病變情況,對HE 染色結果圖進行病理學評分[8],Masson染色結果圖用Image J 進行定量分析。

1.3.3 免疫組化

微波處理(0.01 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液,pH6.0)石蠟切片(4 μm),用5% BSA 室溫封閉樣本組織30 min,使用單克隆小鼠抗 CK19、Ki67 抗體(稀釋 1 ∶100;Abcam),對照組滴加 1% BSA,置于濕盒中4℃過夜。 于第2 天取出玻片,滴加預先按說明書稀釋的二抗,將玻片置于濕盒中,放于37℃溫箱靜置30 min。 配制DAB 顯色液,滴加于切片組織上,鏡下觀察顯色變化。 于玻片上滴加蘇木素染色劑覆蓋組織,室溫靜置5~10 s,流水沖洗干凈,脫水封片。 于光學顯微鏡下觀察陽性分布情況,并用Image J 定量分析。

1.3.4 qPCR 檢測Il6、Tnfa、Il1b、Timp1、Tgfb和Col1 的 mRNA 表達水平

用TRIzol 法按說明書步驟提取各組肝組織的總RNA,將 RNA 逆轉錄成 cDNA 后進行PCR 擴增反應。 以Gapdh作為內參,目的基因mRNA 表達量用 2-ΔΔCt計算,引物序列見表 1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers used in the study

1.3.5 Western blot

提取各組細胞總蛋白,用BCA 法測濃度,每孔取60 μg 蛋白樣品上樣進行 SDS-PAGE 電泳,用BioRad 標準轉膜裝置進行濕式轉膜,5%脫脂牛奶室溫封閉 2 h,分別加入 mTOR、P-mTOR、AKT、PAKT(Ser473)、p65 或 P-p65 一抗 4℃冰箱搖床孵育過夜,洗膜,二抗孵育1.5 h,加ECL 顯影液曝光顯影,用Image Lab 軟件分析結果,將目的蛋白灰度值/對應內參蛋白灰度值的比值作統(tǒng)計學分析,實驗重復4 次。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析處理,呈正態(tài)分布的計量資料以平均數(shù)±標準差()表示,兩組間數(shù)據(jù)比較用獨立樣本t檢驗,多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RAPA 可改善DDC 飲食誘導的小鼠肝內膽管病理學特征

通過HE 染色和Masson 染色可見,正常組小鼠肝未見明顯異常(圖 1b、1c)。 DDC 組小鼠膽管周圍見及明顯炎性細胞浸潤,大量膠原纖維沉積,膽管異常增生,結構紊亂;而RAPA 治療組小鼠膽管周圍炎性細胞浸潤、膠原纖維沉積現(xiàn)象顯著減輕,膽管增生有所緩解。 通過定量分析進一步顯示,與DDC 組相比,RAPA 治療組小鼠炎癥病理評分明顯降低(圖1d,P< 0.05),纖維沉積減少(圖1e,P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 小鼠肝組織病理學變化Note. a, Modeling schematic diagram. b, HE staining. c, Masson staining of mice liver of each group. d, HE staining pathological score. e, Quantitative analysis of Masson staining (n = 4). Compared to the corresponding group,*P< 0.05,**P< 0.01,****P< 0.0001.Figure 1 Pathological changes in liver tissue in mice

2.2 RAPA 可抑制DDC 誘導的小鼠肝中膽管上皮細胞的增生

為了進一步證實RAPA 抑制DDC 誘導的膽管上皮細胞增生情況,我們通過免疫組織化學染色檢測了膽管增生相關標志物CK19、Ki67 的表達。 如圖2 所示,與正常小鼠相比,DDC 飲食組小鼠肝CK19(圖 2a 和 2b;P< 0.01)、Ki67(圖 2c 和 2d;P<0.0001)的陽性分布區(qū)域明顯增多。 而RAPA 處理后,CK19 陽性區(qū)域(P<0.01)和Ki67 陽性區(qū)域(P<0.001)明顯降低,因此,RAPA 可顯著抑制DDC 誘導的膽管損傷。

圖2 DDC 飲食導致各組小鼠肝中CK19、Ki67 的表達變化Note. a-b,Positive distribution of CK19 and Ki67 in the livers of each group of mice. c-d,Quantitative analysis of CK19 and Ki67 expression(n=4).Compared to the corresponding group,****P< 0.0001,***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05.Figure 2 The DDC diet resulted in changes in expression of CK19 and Ki67 in the livers of each group of mice

2.3 RAPA 可降低DDC 飲食誘導小鼠肝炎癥和纖維化相關因子的水平

我們進一步采用qRT-PCR 檢測了炎癥(Il6、Tnfa和Il1b)和纖維化(Timp1、Tgfb和Col1)相關因子的基因水平。 與正常小鼠相比,DDC 組中小鼠肝組織中Il6(圖 3a,P< 0.0001)、Tnfa(圖 3b,P<0.01)、Il1b(圖 3c,P< 0.001)及Timp1(圖 3d,P<0.0001 )、Tgfb(圖 3e,P< 0.0001)和Col1(圖 3f,P<0.0001)mRNA 相對表達水平均明顯升高,說明DDC 飲食可引起小鼠肝炎癥和纖維化,分別與結果1 HE 染色中炎性細胞浸潤和Masson 染色中纖維沉積的病理結果相一致。 而在RAPA 干預后,這些炎癥和纖維化相關因子的mRNA 表達水平均明顯降低(圖3a~3d,P<0.01),說明 RAPA 能減輕 DDC 引起的小鼠肝炎癥和纖維化。

2.4 RAPA 可能通過調控 Akt/mTOR/ NF-κB 信號通路抑制DDC 誘導的膽管損傷

為了進一步探討RAPA 抑制DDC 誘導的膽管損傷的分子機制,由于 RAPA 作為 mTOR 的抑制劑,與正常小鼠相比,給與RAPA 之后總的mTOR不會發(fā)生改變,而磷酸化的mTOR(P-mTOR)表達降低,這一現(xiàn)象已有文獻報道[9],而且單純給與RAPA并不會激活p65 和P-p65[10],因此我們進一步通過Western blot 檢測 DDC 組和 DDC+RAPA 組小鼠肝mTOR、P-mTOR、AKT、P-AKT(Ser473)、p65 和 P-p65 活化情況。 結果顯示,與 DDC 組小鼠相比RAPA 干預后,P-AKT(Ser473)、P-mTOR 和 P-p65(圖4a)活化水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(圖 4b~4d,P< 0.05)。 上述結果提示:RAPA 可能通過調控Akt/mTOR/ NF-κB 信號通路改善DDC 誘導的原發(fā)性硬化性膽管炎。

圖4 小鼠肝組織中mTOR、P-mTOR、AKT、P-AKT(Ser473)、p65 和 P-p65 蛋白表達變化Note. a, Expression of AKT, P-AKT (Ser473), mTOR, P-mTOR, p65 and P-p65 in liver of mice in each group was detected by Western blot. b-d, Quantitative analysis of protein expression(n=4). Compared to the corresponding group, **P< 0.01,*P< 0.05.Figure 4 Changes in protein expression in mTOR, P-mTOR,AKT, P-AKT(Ser473), p65 and P-p65 in mice liver

3 討論

原發(fā)性硬化性膽管炎是一種罕見的慢性膽汁淤積性肝病,其特征是肝內或肝外膽管狹窄或兩者兼有,并伴有膽周炎癥和膽管纖維化。 膽管和肝的炎癥和纖維化會繼之發(fā)展為膽汁生成或循環(huán)障礙,以及進行性肝功能障礙[11-12]。 DDC 飲食誘導的小鼠肝損傷模型是一種經(jīng)典的進行性膽汁淤積性肝損傷模型,研究顯示該模型導致的小鼠膽汁淤積性肝損傷,在發(fā)病機制和臨床表現(xiàn)上均可模擬人類原發(fā)性硬化性膽管炎[13]。 有研究報道,DDC 飲食一周的小鼠,其肝即出現(xiàn)明顯的膽管反應(ductal reaction, DR),表現(xiàn)為膽管上皮樣增生并伴有炎癥細胞浸潤,隨著DDC 的持續(xù)作用,肝中出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤和成纖維母細胞活化,逐漸形成洋蔥皮樣膽管損傷[14-16]。

本研究成功構建了DDC 誘導膽汁淤積性膽管損傷動物模型,并深入揭示雷帕霉素對膽汁淤積性膽管損傷的作用及分子作用機制。 本研究利用了HE 染色及Masson 染色法詳細觀察了各組小鼠肝病理變化情況,結果顯示模型組小鼠肝膽管周有炎性細胞浸潤和膽管增生,并伴隨有膠原纖維的沉積,這與Jansen 等[17]的結果相一致。 而RAPA 治療組膽管周炎性細胞的浸潤明顯減少,膠原纖維沉積現(xiàn)象明顯減輕。 證實RAPA 可以減輕DDC 誘導的小鼠肝炎性浸潤,膽管增生和纖維化。 細胞角蛋白(CK19)不存在于成體肝細胞中而主要存在于肝祖細胞和膽管上皮細胞(BECs)中,是最廣泛使用的膽管細胞和肝祖細胞標記物[18],也是膽管反應標志物[19],Ki67 表達于活躍分裂的細胞核中[20],是細胞增殖的標志物[19-21],我們的結果顯示,RAPA 治療可以顯著下調 DDC 飲食引起的CK19 和Ki67 的高表達,表明RAPA 可以抑制膽管上皮細胞的增殖。已有的報道及我們的結果(圖1b~1c)均顯示DDC飲食可誘導肝匯管區(qū)周圍炎癥細胞的浸潤和膠原沉積[22],故在本研究中,我們運用qRT-PCR 進行進一步驗證和補充,分析了相關炎性細胞因子Il6、Tnfa和Il1b的表達,RAPA 處理后可以明顯降低這些促炎細胞因子的水平,肝纖維化相關指標Timp1、Tgfb和Col1 是小鼠進行性膽管纖維蛋白基因,可在一定程度上反映纖維化的發(fā)展[14],在RAPA 處理后也被抑制。 已有文獻研究表明,肝炎癥反應能促進肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[1-2],本研究發(fā)現(xiàn)在DDC 喂食小鼠后,其肝中NF-κB p65 磷酸化水平及其下游炎癥因子明顯升高,且纖維化化程度明顯加重,而經(jīng)RAPA 治療后,NF-κB p65 磷酸化水平降低且炎癥因子表達水平明顯降低,并伴隨肝纖維化程度得到也明顯改善,這些結果顯示 RAPA 可能通過抑制肝膽管炎癥來改善DDC 誘導的膽汁淤積性肝纖維化,但具體機制還仍需要進一步探討。

圖 3 DDC 飲食誘導小鼠肝中 Il6、 Tnfa、Il1b、Timp1、Tgfb 和 Col1 的 mRNA 表達變化Note. a-f, Relative expression of Il6, Tnfa, Il1b, Timp1, Tgfb and Col1 in liver tissues of mice in each group was detected by qRT-PCR,respectively(n=4). Compared to the corresponding group,****P< 0.0001,***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05.Figure 3 The DDC diet induced changes in mRNA expressionin the mice livers of Il6, Tnfa, Il1b, Timp1, Tgfb and Col1

NF-κB 被認為是典型的促炎信號轉導途徑,p65作為NF-κB 最常見的亞基組成形式,被磷酸化修飾后被轉運到細胞核內促進促炎基因的表達,包括細胞因子,趨化因子和粘附分子[23]。 過度活化的p65可促進效應分子(如炎癥因子)產生,導致炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展,因此,NF-κB p65 信號通路已經(jīng)成為藥物研發(fā)的關鍵點[10]。 研究表明戊酸(EA)對LPS 誘導的RAW264.7 細胞具有抗炎作用,并且可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR/NF-κB 信號通路并抑制LPS 誘導的炎性介質產生[24]。 還有研究表明TIPE2 通過調節(jié) Akt/mTOR /NF-κB 信號軸促進人肺癌細胞的增殖,存活,侵襲和遷移[25]。 這些研究都證實了Akt/mTOR/NF-κB 信號通路在炎癥和增生的發(fā)生發(fā)展中都起著關鍵作用,已知mTOR 和NF-κB 都是 Akt 的下游效應子,通過 Akt 進行的信號傳遞可能會通過mTOR 或NF-κB 在兩個互斥和獨立的方向上進行,mTOR 可通過反饋機制調節(jié)Akt,還可以通過mTOR 相關蛋白受體調節(jié)Akt 來幫助 mTOR 調節(jié) NF-κB[26]。 本研究結果顯示,在給與RAPA 治療后,P-mTOR、P-Akt、NF-κB P-p65 的磷酸化水平降低,而總的 mTOR、Akt、NF-κB p65 未見明顯變化,說明RAPA 作為mTOR 的抑制劑能有效抑制DDC 激活的Akt/mTOR/NF-κB 信號通路的磷酸化水平,從而改善由DDC 誘導的膽管周圍炎癥,進而改善膽管損傷。

綜上,我們研究了RAPA 在DDC 誘導的小鼠原發(fā)性硬化性膽管炎作用,結果顯示RAPA 可改善DDC 飲食誘導的小鼠膽管損傷和炎癥反應。 本研究發(fā)現(xiàn)RAPA 可能通過抑制 Akt/mTOR /NF-κB 信號通路從而抑制炎性介質的產生,進而改善DDC 誘導的小鼠膽管損傷。 因此RAPA 有望成為治療膽汁淤積性膽管損傷的有效藥物,本研究結果將為PSC 患者臨床治療靶點和新型藥物的研發(fā)提供一定的實驗基礎。