余 煊杜力軍秦 川*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021;2.清華大學(xué)蛋白質(zhì)科學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室,生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥物藥理實驗室,北京 100084)

薄荷(Mentha haplocalyx Briq),作為重要的藥用植物,在我國種植和使用歷史源遠(yuǎn)流長。 其命名有“菝葀”(揚(yáng)雄·甘泉賦),“茇艸舌”(呂沉·字林),“番荷”(孫思邈·千金方),“菝蘭”(陳士良·食性本草),直至李時珍的本草綱目中才稱作“簿荷”[1]。薄荷在歐洲醫(yī)學(xué)和西方醫(yī)學(xué)的推廣使用則要到18世紀(jì)后。 薄荷醇(menthol),也稱為薄荷腦,是一種環(huán)類單萜,主要存在于薄荷屬草本植物,被用于胃腸道[2-3]、呼吸道[4]、泌尿生殖系統(tǒng)[5]炎癥的治療。薄荷醇與薄荷酮、異薄荷酮、一起賦予薄荷屬植物新鮮和清涼的氣味。 薄荷醇有4 對光學(xué)異構(gòu)體,其中(-)-薄荷醇從薄荷草藥中分離出來,擁有清新的薄荷味和多種藥理學(xué)活性,包括鎮(zhèn)咳[6]、鎮(zhèn)痛[7]、止癢[8]、抗菌[9]、抗炎[10-12]、抗腫瘤[13-14]等(圖 1)。

瞬時受體電位 TRPM8 ( transient receptor potential melastatin-related 8),又稱冷和薄荷醇誘導(dǎo)受體CMR-1(cold and menthol induced receptor-1),屬于瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)家族[15-16]。 TRPM8 是一個具有六次跨膜結(jié)構(gòu)域的非選擇性陽離子通道,N 末端和C 末端位于胞內(nèi)(圖1),可以被冷和具有冷屬性的化合物激活,如薄荷醇、Icilin、桉樹油等[17-20]。

圖1 薄荷醇和TRPM8Note. N, Amino terminal. C, Carboxyl terminal.Figure 1 Menthol and TRPM8

炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,當(dāng)機(jī)體暴露于感染性病原體,或遭遇物理或化學(xué)損傷時發(fā)生的一種防御反應(yīng)。 神經(jīng)系統(tǒng)炎癥會影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能,強(qiáng)迫癥[21]、阿爾茲海默癥[22]、中風(fēng)[23]、創(chuàng)傷性腦損傷[24]等疾病都伴隨神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥。目前有多個研究工作,通過小鼠模型或細(xì)胞模型表明薄荷醇對炎癥反應(yīng)的一直與TRPM8 受體相關(guān)。Ramachandran 等[25]發(fā)現(xiàn),在小鼠結(jié)腸炎模型中,薄荷醇和Icilin(TRPM8 激動劑)對小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)有緩解作用。 Juergens 等[26]發(fā)現(xiàn) L-薄荷醇在體外可以顯著抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生PGE、LTB,IL-1β 等炎癥因子的釋放。 除了薄荷醇,其他一些可以激活TRPM8 受體的因素,如低溫[27]、Icilin[28]、桉樹油[29]等,據(jù)研究報道也對炎癥反應(yīng)具有抑制作用。 本研究工作通過小鼠模型和細(xì)胞模型,主要探討了薄荷醇對神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的抑制作用及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

本實驗使用SPF 級ICR 雄性8 周齡小鼠購自華阜康公司[SCXK(京)2019-0008],體重約22 g,共24 只。 實驗小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所小鼠SPF 屏障設(shè)施[SYXK(京)2018-0019],恒溫恒濕,12 h/12 h 固定明暗周期,提供充足的無菌飲水、墊料和食物。 本研究工作中涉及的動物實驗內(nèi)容和所需動物數(shù)量通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所倫理審查委員會的審批(IACUC QC18002),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 實驗細(xì)胞

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12 細(xì)胞),購自ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

(-)-薄荷醇(63660-1G)和DMSO 購自Sigma Aldrich(美國);ECL 底物檢測試劑盒(10095983)和蛋白質(zhì) Marker 購自 Thermo-Scientific;0.9% NaCl、PBS 和鈣離子熒光探針Fluo-3AM、RIPA 蛋白裂解液(P0013B)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型P0010)、蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE 預(yù)混液、蛋白電泳液、半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)緩沖液、TBST、封閉液購自碧云天生物技術(shù)有限公司;動物組織總RNA 提取試劑盒(DP451)購自天根生化有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物和細(xì)胞分組

24 只小鼠,隨機(jī)分為對照組(C),溶媒對照組(VC,含0.1% DMSO 生理鹽水),薄荷醇高劑量組(50 mg/kg)和薄荷醇低劑量組(10 mg/kg),通過尾靜脈注射方式進(jìn)行給藥。 90 min 后,頸椎脫臼處死小鼠,解剖取材獲得小鼠腦組織,分離下丘腦核團(tuán)部分,液氮速冷后-80℃低溫保存。

PC12 細(xì)胞分為空白對照組、薄荷醇給藥組(低劑量200 nmol/L 和高劑量500 nmol/L)。 給藥3 h后,收集細(xì)胞,進(jìn)行RNA 和蛋白抽提。

1.3.2 鈣成像實驗

鈣離子熒光探針Fluo-3AM(5 mmol/L)以PBS稀釋至1 μmol/L 工作液。 細(xì)胞培養(yǎng)皿吸盡培養(yǎng)基后,用無菌 PBS 清洗3 次,清除殘留血清后,加入Fluo-3AM 工作液于37℃避光孵育15 min,然后用無菌PBS 清洗 3 遍。 用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP8)選取合適的視野進(jìn)行拍照。 所得圖片結(jié)果,進(jìn)行熒光強(qiáng)度統(tǒng)計分析。

1.3.3 熒光實時定量PCR

動物組織總RNA 提取試劑盒提取小鼠腦組織樣本和PC12 細(xì)胞樣本的總RNA,NanoDrop 分光光度檢測所提RNA 濃度和純度。 FastKing 一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒(SYBR Green) (天根,FP313)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR 和熒光實時定量PCR。 反應(yīng)體系為:①2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green) 25 μL,②25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 1.25 μL,③RNase-Free ddH2O 將總體系補(bǔ)齊至50 μL。 反應(yīng)步驟:①逆轉(zhuǎn)錄,50℃,30 min;②預(yù)變性,95℃,3 min;③PCR 擴(kuò)增,95℃,15 s → 60℃,30 s,40 個循環(huán);④溶解曲線分析。 引物序列如表1 所示。

表1 Real-time PCR 引物設(shè)計Table 1 Primers for Real-time PCR

1.3.4 免疫熒光標(biāo)記

將處于生長對數(shù)期的PC12 細(xì)胞接種至24 孔板(密度約為15%),分為對照組和薄荷醇高劑量組(500 nmol/L),細(xì)胞貼壁生長至40%左右時進(jìn)行給藥處理。 藥物處理后的細(xì)胞以4%多聚甲醛固定液室溫固定,隨后加入0.1%的TritionTM-X-100 通透。以1%的BSA 進(jìn)行封閉,隨后加入目標(biāo)基因一抗和二抗孵育,二抗孵育時注意避光。 熒光標(biāo)記后的細(xì)胞,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。 所得結(jié)果可進(jìn)行熒光強(qiáng)度統(tǒng)計分析。 進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記時,按如下順序進(jìn)行:表達(dá)量較低的蛋白一抗→二抗孵育→二次封閉→表達(dá)量較高的蛋白一抗→二抗孵育。

1.3.5 蛋白免疫印記

使用RIPA 蛋白裂解液進(jìn)行組織或細(xì)胞樣本的蛋白質(zhì)抽提,使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。 免疫熒光和蛋白免疫印跡中使用的抗體見表2。

表2 免疫熒光和蛋白免疫印跡抗體Table 2 Antibodies for Western blot and IF

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,所有數(shù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。 所得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時,對組內(nèi)前后差異比較采用配對樣本t檢驗,組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。*P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,**P<0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,***P<0.001 為差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 薄荷醇對小鼠下丘腦中TRPM8 蛋白表達(dá)的調(diào)控作用

下丘腦(hypothalamus)屬于機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng),分布于下丘腦不同區(qū)域的神經(jīng)元通過對溫度、滲透壓、血糖等因子的敏感,參與體溫調(diào)節(jié)、攝食飲水、內(nèi)分泌、情緒反應(yīng)等眾多生理活動。 分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)的TRPM8 是機(jī)體的溫度感受器,對冷和薄荷醇敏感。 我們通過體內(nèi)實驗,檢測位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的TRPM8 是否對薄荷醇敏感。

如圖2 所示,ICR 小鼠經(jīng)尾靜脈注射薄荷醇3 h后,通過蛋白免疫印跡檢測小鼠下丘腦中瞬時受體電位TRPM8、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和炎癥因子TNF-α表達(dá)的變化。 結(jié)果顯示,相比對照組,薄荷醇高劑量(50 mg/kg)和低劑量(10 mg/kg)組小鼠下丘腦中TRPM8 蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01),NF-κB和TNF-α 蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。

圖2 注射薄荷醇小鼠蛋白表達(dá)情況Note. C, Control group. VC, Vehicle control group. Compared with control group,**P<0.01.Figure 2 Protein expression of mice injected with menthol

2.2 PC12 細(xì)胞對薄荷醇的響應(yīng)

高度分化的PC12 細(xì)胞是具有神經(jīng)元生物特性的神經(jīng)元樣細(xì)胞,被廣泛用于神經(jīng)毒性、神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)分泌、神經(jīng)炎癥和突觸損傷等多個領(lǐng)域的研究工作,是神經(jīng)生物學(xué)體外實驗中理想的細(xì)胞模型[30-32]。 微 管 相 關(guān) 蛋 白 (microtubule-associated protein-2)是神經(jīng)元細(xì)胞的骨架蛋白,參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、形成和再生等重要生物過程[33]。 如圖3A 所示,在PC12 細(xì)胞中進(jìn)行神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2 的原位表達(dá),結(jié)果顯示,本研究工作中使用的PC12 已經(jīng)分化為具有神經(jīng)元特性的細(xì)胞。

隨后,通過鈣成像技術(shù),我們在檢測薄荷醇對PC12 細(xì)胞的作用。 Fluo-3 AM 是常用的鈣離子熒光探針之一,游離形式的Fluo3 不具有熒光特性,與細(xì)胞中的鈣離子結(jié)合后會產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。 如圖3B 所示,在 488 nm 激發(fā)光下,薄荷醇(200 nmol/L)在PC12 細(xì)胞中引發(fā)強(qiáng)烈的鈣內(nèi)流反應(yīng)。通過平均熒光強(qiáng)度分析顯示,相比對照組(MFI:61.07± 5.01),薄荷醇組的平均熒光強(qiáng)度為(158.29±14.07),與對照組相比具有極顯著差異(P< 0.001)。 上述結(jié)果表明,具有神經(jīng)元屬性的PC12 細(xì)胞可以很好的模擬小鼠下丘腦中神經(jīng)元細(xì)胞對薄荷醇的響應(yīng)。

圖3 薄荷醇處理PC12 細(xì)胞Note. Compared with control group,***P<0.001. Menthol concentration, 200 nmol/L.Figure 3 PC12 cells with menthol

2.3 薄荷醇對PC12 細(xì)胞中TRPM8 表達(dá)的調(diào)控作用

通過熒光實時定量PCR,在mRNA 水平檢測薄荷醇對 PC12 細(xì)胞中 TPRM8、NF-κB 和 TNF-α 表達(dá)的變化。 結(jié)果如圖4A~4C 所示,200 nmol/L 和500 nmol/L 的薄荷醇均可以促進(jìn)TRPM8 的表達(dá),同時下調(diào) NF-κB 和 TNF-α 的轉(zhuǎn)錄水平。 薄荷醇在轉(zhuǎn)錄水平對 TRPM8,NF-κB 和 TNF-α 表達(dá)的調(diào)控作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。

借助免疫熒光雙標(biāo)記實驗,分別使用FITC(綠色)標(biāo)記細(xì)胞中的TRPM8 蛋白,Alex649 (紅色)標(biāo)記細(xì)胞中的TNF-α 蛋白,結(jié)果如圖4D~4E 顯示,相比對照組,給藥組(薄荷醇 500 nmol/L)中TRPM8(綠色)的平均熒光強(qiáng)度顯著升高,TNF-α(紅色)的平均熒光強(qiáng)度下降。 以上結(jié)果表明,在mRNA 和蛋白水平,薄荷醇對TRPM8 的表達(dá)具有激活作用,對TNF-α 的表達(dá)具有抑制作用。

圖4 薄荷醇對基因表達(dá)的影響Note. D/E, Menthol concentration, 500 nmol/L. Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.Figure 4 Effect of menthol on the gene expression

2.4 薄荷醇對 PC12 細(xì)胞(TRPM8 敲低)中相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用

為了進(jìn)一步驗證TRPM8 蛋白與TNF-α 的負(fù)相關(guān)性,我們使用 TRPM8 敲低的 PC12 細(xì)胞(KD 細(xì)胞)進(jìn)行實驗。 KD 細(xì)胞由清華大學(xué)藥理實驗室提前構(gòu)建提供。 如圖5A 所示,在KD 細(xì)胞中,TRPM8(紅色)的熒光強(qiáng)度顯著減弱,表明細(xì)胞中TPRM8蛋白含量降低。 所以我們進(jìn)一步比較了薄荷醇在野生型 PC12 細(xì)胞(WT 細(xì)胞) 和 KD 細(xì)胞中對TRPM8 和 TNF-α 表達(dá)的影響,結(jié)果如圖 5B~5D 所示,在加入200 nmol/L 和500 nmol/L 薄荷醇時,KD細(xì)胞中,薄荷醇不能激活細(xì)胞中TRPM8 的表達(dá),同時,薄荷醇失去對細(xì)胞中 NF-κB 和 TNF-α 的抑制作用,并且激活了 TNF-α 表達(dá)(P< 0.01)。 這一結(jié)果證實,在TRPM8 的表達(dá)降低后薄荷醇對TRPM8 和TNF-α 的負(fù)調(diào)控作用受到影響。

圖5 薄荷醇對TRPM8 敲低細(xì)胞作用Note. WT, Wild type PC12 cells. KD, PC12 cells with TRPM8 knockdown. C, Control group. Compared with control group,**P<0.01.Figure 5 Effect of menthol on TRPM8 knockdown cells

3 討論

TRPM8 是一種重要的溫度感受器受體,環(huán)境低溫通過激活分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)的TRPM8 受體,引起鈣離子內(nèi)流,進(jìn)一步通過電興奮將環(huán)境溫度變化信息傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng),產(chǎn)生相應(yīng)溫度變化的“冷感覺”。 除了低溫,TRPM8 受體還可以被薄荷醇及其類似激活,同樣通過電興奮,產(chǎn)生“冷感覺”。已有的研究表明,在腦缺血、顱腦外傷、心臟驟停等疾病中,適當(dāng)降低機(jī)體體溫,有利于抑制炎癥反應(yīng)。長期以來,薄荷醇作為一種天然小分子藥物因其抗炎鎮(zhèn)痛的效應(yīng)被廣泛使用。 同時,低溫和薄荷醇都可以抑制炎癥反應(yīng)。 因此,在本研究工作中,我們主要探討了薄荷醇對炎癥反應(yīng)的抑制作用是否與其對冷敏感受體TRPM8 的激活相關(guān)。

我們在體內(nèi)實驗(小鼠模型)和體外實驗(PC12細(xì)胞模型)中都發(fā)現(xiàn),薄荷醇可以促進(jìn)TRPM8 的表達(dá),抑制 NF-κB 和 TNF-α 的表達(dá)。 進(jìn)一步,PC12 細(xì)胞中當(dāng) TRPM8 的表達(dá)降低,薄荷醇無法激活TRPM8,進(jìn)一步改變對TNF-α 表達(dá)的作用。 這證實了薄荷醇對炎癥因子的抑制作用依賴于其對TRPM8 的激活作用。 此外,在細(xì)胞模型中,我們還發(fā)現(xiàn)薄荷醇對TRPM8 的激活包括兩個層面:1)一方面,薄荷醇可以誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞產(chǎn)生鈣內(nèi)流現(xiàn)象,激活位于細(xì)胞膜的TRPM8 作為膜受體的離子通道屬性。 2)分子層面,通過免疫熒光成像,可以直觀的檢測到PC12 細(xì)胞胞漿中TRPM8 蛋白表達(dá)水平被薄荷醇上調(diào)。 分布于細(xì)胞膜表面和胞漿中的TRPM8 蛋白具有不同的生物學(xué)特點(diǎn),位于胞漿中的TRPM8 蛋白可能作為信號分子,影響下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[34]。

NF-κB 作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子,廣泛表達(dá)于哺乳動物組織細(xì)胞中,主要參與機(jī)體對外界刺激的響應(yīng),在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中具有重要作用。 分布于胞漿的NF-κB 與IκB 結(jié)合形成無活性的二聚體,當(dāng)受到細(xì)胞外信號激活時,IκB 激酶 IKK 被激活,IκB 降解后使 NF-κB 從 NF-κB-IκBs 復(fù)合物中解離,游離的NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[35-36]。 在實驗中我們發(fā)現(xiàn),無論是在小鼠還是細(xì)胞模型中,薄荷醇對 NF-κB 和 TNF-α 表達(dá)的調(diào)控具有相同趨勢。 薄荷醇可以激活胞漿中TPRM8 的表達(dá),位于胞漿中的 TRPM8 蛋白與 NF-κB 蛋白具有共同的空間,因此薄荷醇激活TRPM8 對 TNF-α 的負(fù)調(diào)控作用可能有核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 介導(dǎo)。 綜上所述,薄荷醇能夠激活TRPM8,并通過TRPM8 影響了核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 及其下游炎癥因子 TNF-α。該結(jié)果為薄荷醇抑制炎癥反應(yīng)可能的分子機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)和思考方向,為薄荷醇的臨床應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。