王冬海，任力，李騰，鄭吉春，朱建平

0 引言

甲狀腺乳頭狀癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占所有甲狀腺癌的85%～90%，大多數(shù)甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）進(jìn)展緩慢，侵襲性較弱，10年生存率達(dá)95%以上[1]，隨著高分辨率彩超的普及應(yīng)用及人們對(duì)甲狀腺體檢意識(shí)的提高，部分PTC患者早期就檢測(cè)出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，甚至是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中一些病例不乏是甲狀腺微小乳頭狀癌。根據(jù)2017版WHO內(nèi)分泌器官腫瘤分類的標(biāo)準(zhǔn)，將甲狀腺乳頭狀癌分為15個(gè)病理亞型，其中部分甲狀腺乳頭狀癌病理亞型具有高侵襲性。越來(lái)越多的研究表明，S100A14和LOXL2在消化道腫瘤和婦產(chǎn)科腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用，而二者在甲狀腺乳頭狀癌中的研究鮮有報(bào)道[2-3]。本試驗(yàn)運(yùn)用免疫組織化學(xué)法對(duì)甲狀腺乳頭狀癌組織中鈣結(jié)合蛋白S100A14和賴氨酰氧化酶（LOXL）2的表達(dá)水平進(jìn)行半定量檢測(cè)，并結(jié)合臨床病理資料分析，探討二者之間的相關(guān)性及其與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2019年12月空軍特色醫(yī)學(xué)中心甲狀腺乳頭狀癌753例，通過(guò)對(duì)組織切片重新閱片、判讀，從中隨機(jī)篩選出30例經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌（classic papillary thyroid carcinoma,CPTC）、30例高侵襲性甲狀腺乳頭狀癌（包括6例鞋釘樣亞型、7例實(shí)體/梁狀亞型、8例柱狀細(xì)胞亞型、9例高細(xì)胞亞型甲狀腺乳頭狀癌病例）和30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫病例（nodular goiter,NG），以上病例均經(jīng)病理證實(shí)。30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者年齡28～70歲，平均年齡（53.4±9.84）歲，男女比例為1∶5；30例CPTC患者年齡18～57歲，平均年齡（37.8±10.49）歲，男女比例為1∶2；30例高侵襲性PTC患者年齡26～65歲，平均年齡（40.57±11.52）歲，男女比例為1∶5。在60例PTC中（包括CPTC組和高侵襲組），22例腫瘤直徑≥2 cm，38例直徑＜2 cm；其中37例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，23例未轉(zhuǎn)移。CPTC和高侵襲組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次入住本院且經(jīng)手術(shù)冰凍或術(shù)后病理確診；（2）臨床資料和病理資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷不明確或腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)極少；（2）轉(zhuǎn)移性甲狀腺腫瘤或伴有其他轉(zhuǎn)移惡性腫瘤病史。根據(jù)2018版AJCC甲狀腺乳頭狀癌分期標(biāo)準(zhǔn)，30例CPTC中有2例Ⅱ期，28例Ⅰ期；30例高侵襲性PTC中，1例Ⅱ期，29例Ⅰ期；所有PTC患者均給予甲狀腺癌根治術(shù)+區(qū)域淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)中神經(jīng)檢測(cè)（NIM3.0）、納米碳淋巴結(jié)顯影示蹤。本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍空軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 組織芯片

90例PTC組織和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織蠟塊由北京龍邁達(dá)斯科技開(kāi)發(fā)有限公司代加工為組織芯片，芯片直徑為1.5 mm，切片厚度4 μm，主要分為以下幾個(gè)步驟：（1）芯片微陣列設(shè)計(jì)；（2）評(píng)估蠟塊、確定研究目標(biāo)區(qū)域；（3）TMA受體蠟塊制備；（4）點(diǎn)樣、再包埋；（5）切片、撈片；（6）質(zhì)控。

1.3 主要試劑及方法

S100A14抗體和LOXL2抗體均為兔多克隆抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所需配制的最佳滴度S100A14為1∶2 000，LOXL2為1∶200。免疫組織化學(xué)方法為SP法，試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，所有操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，分別用前期預(yù)試驗(yàn)證實(shí)陽(yáng)性的食管上皮和胎盤組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定[4]

S100A14和LOXL2分別以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)著色為主。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)采用半定量計(jì)數(shù)法，即按著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行結(jié)果判定，按染色強(qiáng)度：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按著色細(xì)胞百分比，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。兩者的乘積作為總積分，總分0分為-，1～5分為弱+，5～8分為+，8～12分為++?？偡郑?分為陰性表達(dá)，≥5分為陽(yáng)性表達(dá)，5～8分為低表達(dá)，8～12分為高表達(dá)。所有結(jié)果均由兩位病理科醫(yī)師在雙盲情況下進(jìn)行計(jì)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)，當(dāng)出現(xiàn)1＜T＜5時(shí)，改用卡方檢驗(yàn)的校正公式或者用Fisher精確檢驗(yàn)，S100A14和LOXL2表達(dá)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A14和LOXL2在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)

S100A14的陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，以細(xì)胞膜上分布更典型，表達(dá)強(qiáng)度在NG組、CPTC組、高侵襲組逐步呈上升趨勢(shì)（χ2=37.542,P=0.000)。LOXL2陽(yáng)性表達(dá)定位主要位于細(xì)胞質(zhì)，個(gè)別病例出現(xiàn)細(xì)胞核著色，表達(dá)強(qiáng)度在NG組、CPTC組、高侵襲組逐步呈上升趨勢(shì)（χ2=26.809,P=0.000）。S100A14和LOXL2在經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌與高侵襲性甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.667,P=0.01;χ2=5.934,P=0.015），見(jiàn)圖1～2、表1。

表1 S100A14和LOXL2在甲狀腺不同病變組織中的表達(dá)情況Table 1 Expression of S100A14 and LOXL2 in different thyroid lesions

圖1 S100A14在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(A,SP×300)、經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌(B,SP×500)和高侵襲性實(shí)體/梁狀亞型甲狀腺乳頭狀癌(C,SP×500)中的表達(dá)Figure 1 Expression of S100A14 in nodular goiter(A,SP×300),classic papillary thyroid carcinoma (B,SP×500) and highly invasive solid/trabecular variant of papillary thyroid carcinoma (PTC) (C,SP×500)

2.2 S100A14和LOXL2的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床參數(shù)的關(guān)系

S100A14在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理亞型具有顯著相關(guān)性，而與患者的年齡、腫瘤大小、多灶性無(wú)關(guān)。LOXL2在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)與病理亞型具有顯著相關(guān)性，而與患者的年齡、腫瘤大小、多灶性無(wú)關(guān)，見(jiàn)表2。

圖2 LOXL2在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(A,SP×300)、經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌(B,SP×500)和高侵襲性鞋釘樣亞型甲狀腺乳頭狀癌 (C,SP ×500)中的表達(dá)Figure 2 Expression of LOXL2 in nodular goiter (A,SP×300),classic papillary thyroid carcinoma (B,SP×500) and highly invasive hobnail variant of PTC (C,SP ×500)

2.3 甲狀腺乳頭狀癌組織中S100A14與LOXL2表達(dá)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在60例甲狀腺乳頭狀癌組織中，S100A14與LOXL2的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.332,P=0.01），見(jiàn)表3。

表3 S100A14與LOXL2在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)的相關(guān)性Table 3 Relation between S100A14 and LOXL2 expression in PTC

3 討論

3.1 甲狀腺乳頭狀癌

PTC是甲狀腺組織濾泡上皮來(lái)源的惡性腫瘤，雖然是公認(rèn)的分化良好的腫瘤，具有良好的預(yù)后和較高的生存率，但是依然存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，給患者帶來(lái)經(jīng)濟(jì)和精神上的壓力。已經(jīng)證實(shí)一些亞型具有高侵襲性，包括高細(xì)胞亞型、鞋釘樣亞型、柱狀細(xì)胞亞型、實(shí)體/梁狀亞型[5]，具有很高的侵襲性行為和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。有關(guān)研究表明S100A14和LOXL2與很多腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性[6]，但目前有關(guān)二者在甲狀腺病變組織中的研究，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚無(wú)報(bào)道。本文利用免疫組織化學(xué)法探討二者在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)情況及相關(guān)性。

3.2 S100A14與甲狀腺乳頭狀癌

S100A14 是S100 家族的新成員，定位在1q21.3，該區(qū)段穩(wěn)定性差，染色體移位、重組、缺失及擴(kuò)增頻繁，易致S100A14表達(dá)失控，影響S100A14蛋白正常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密[7]。S100A14蛋白功能主要包括細(xì)胞內(nèi)功能和細(xì)胞外功能。細(xì)胞內(nèi)功能主要與二價(jià)鈣離子結(jié)合而發(fā)揮作用，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、周期、侵襲、轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)錄等，參與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。細(xì)胞外功能主要與受體結(jié)合，通過(guò)分泌來(lái)發(fā)揮作用，主要的受體是RAGE[8]，部分也與Toll樣受體4相互作用[9]。S100A14在不同腫瘤中的表達(dá)有明顯差異，具有明顯的組織特異性，在正常結(jié)、直腸、子宮內(nèi)膜、食管組織中呈高表達(dá)，在肺[10]、肝、腎組織中中度表達(dá)，在心臟組織中低表達(dá)，腦、脾、外周血白細(xì)胞不表達(dá)，肝癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌和子宮腫瘤中高表達(dá)[11-13],在腎癌、食管癌、口腔鱗癌、結(jié)直腸癌中低表達(dá)[14-15]。有研究[12]表明細(xì)胞內(nèi)S100A14蛋白通過(guò)p53依賴上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞侵襲。有研究[5]表明，細(xì)胞外低濃度S100A14蛋白可以激活MAPK信號(hào)通路，其中鈣離子發(fā)揮了重要作用。NFKB信號(hào)分子與細(xì)胞增殖、應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)密切相關(guān)，S100A14蛋白對(duì)其也有顯著的激活作用，目前沒(méi)有統(tǒng)一的機(jī)制，各學(xué)者報(bào)道不一。S100A14是具有雙重作用的蛋白，對(duì)腫瘤既有促進(jìn)作用，也有抑制作用[6]，目前研究主要集中于其對(duì)腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移與凋亡的影響。有文獻(xiàn)[16]報(bào)道，S100A14在具有高風(fēng)險(xiǎn)注射藥物行為且在未被HIV感染的人群中高表達(dá)，NK細(xì)胞的數(shù)量和活性增加，提示了其在增強(qiáng)自然免疫方面的潛在功能。王巖等發(fā)現(xiàn)S100A14蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)性卵巢癌中陽(yáng)性率達(dá)87.8%[4]，本研究顯示，S100A14蛋白在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、CPTC及高侵襲性PTC中的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，且任兩組比較均有顯著差異。Hu等[2]通過(guò)Meta分析發(fā)現(xiàn)S100A14的高表達(dá)與腫瘤的分化不良有關(guān)，而在年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中S100A14蛋白的高表達(dá)與PTC的高侵襲亞型有關(guān)，并且S100A14表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，提示S100A14蛋白的陽(yáng)性表達(dá)可能參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移，這與Zhao等[17]在非小細(xì)胞肺癌中的研究一致。本研究尚未證實(shí)與患者年齡、腫瘤大小及多灶性有關(guān)，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本相符。

3.3 LOXL2與甲狀腺乳頭狀癌

LOXL2是賴氨酰氧化酶家族之一，LOXL2基因定位在8p21.2～21.3，11個(gè)外顯子，該區(qū)域染色體易丟失，是一種銅依賴性胺氧化酶，主要作用是催化膠原和彈性蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)中的共價(jià)交聯(lián)，使其纖維化[19]，保持細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性，與多種腫瘤及纖維化疾病的發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等細(xì)胞和組織中表達(dá)上調(diào)，并可通過(guò)促進(jìn)腫瘤相關(guān)纖維化、腫瘤血管的生成在腫瘤微環(huán)境中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性有關(guān)。劉鵬等[20]研究發(fā)現(xiàn)，47例膽管癌組織中LOXL2蛋白陽(yáng)性率達(dá)68.1%，LOXL2 mRNA的表達(dá)為154.63±128.96。田潔等[21]研究發(fā)現(xiàn)，71例卵巢癌病例中LOXL2陽(yáng)性表達(dá)率為78.87%。研究發(fā)現(xiàn)[22]，LOXL2參與了腫瘤微環(huán)境下血管的形成，與乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。相反，也有少量研究表明LOXL2可能起抑癌作用，方堃[23]研究發(fā)現(xiàn)LOXL2在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯低于良性前列腺增生組織。Ye等[24]在研究GINS2與甲狀腺癌增殖和凋亡關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，GINS2的干擾導(dǎo)致了LOXL2的顯著下調(diào)，其調(diào)節(jié)可能與FAK/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)，富含肉豆蔻?；彼岬腸激酶底物樣1（MARCKSL1）可導(dǎo)致該調(diào)節(jié)通路的磷酸化降低，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡蛋白，而LOXL2可直接與MARCKSL1結(jié)合，激活FAK/Akt/mTOR信號(hào)調(diào)節(jié)通路，抑制MARCKSL1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移[25]。本研究顯示，LOXL2蛋白在三組的表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，且任意兩組比較均有顯著差異，由此推斷LOXL2可能參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移；Lin等[26]在腎透明細(xì)胞癌的薈萃分析表明，LOXL2 mRNA的高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LOXL2的表達(dá)與腫瘤大小、多灶性無(wú)關(guān)，且尚未證實(shí)在三組中表達(dá)遞增的趨勢(shì)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能與樣本量不足、缺乏代表性有關(guān)，有待進(jìn)一步分析和研究。

3.4 S100A14與LOXL2的關(guān)系

Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)S100A14蛋白通過(guò)p53依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控MMP-2的表達(dá)和功能，參與細(xì)胞的侵襲，而MMP-2是一類可降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的蛋白酶，在高轉(zhuǎn)移性腫瘤中，MMP-2的高表達(dá)可降解Ⅳ型膠原蛋白，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。LOXL2蛋白的功能是催化細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中膠原蛋白、彈性蛋白的共價(jià)交聯(lián)，Peng等[28]的研究表明，LOXL2的高表達(dá)可以上調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。S100A14與LOXL2高表達(dá)都可以上調(diào)MMP-2的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。二者的交匯點(diǎn)和共同點(diǎn)是都可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。還有研究[28-29]表明二者都可以促進(jìn)腫瘤微血管的形成，具體協(xié)同機(jī)制不詳。本實(shí)驗(yàn)表明S100A14與LOXL2在甲狀腺病變組織中的表達(dá)依次呈遞增趨勢(shì)，通過(guò)Pearson相關(guān)性分析，二者具有顯著相關(guān)性。關(guān)于兩者具體協(xié)同發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.5 S100A14、LOXL2與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系

本課題前期研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌在男性中比例有升高和年輕化的趨勢(shì)，而腫瘤的診治關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)，迫切需要尋找新的蛋白分子或血清學(xué)指標(biāo)，對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)或預(yù)后提示具有重要意義[30]。而S100A14與LOXL2主要集中在婦科腫瘤、消化道腫瘤方面的研究，尚無(wú)在甲狀腺乳頭狀癌中的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，S100A14與LOXL2在甲狀腺乳頭狀癌不同病理亞型中的表達(dá)具有顯著差異，提示對(duì)規(guī)范甲狀腺乳頭狀癌的診治工作具有重要意義，再次強(qiáng)調(diào)對(duì)PTC病理分型的重要性。本實(shí)驗(yàn)尚有不足之處，比如樣本量少、組織芯片采樣產(chǎn)生的誤差、缺乏對(duì)高侵襲性具體亞型討論及抗體表達(dá)情況與患者預(yù)后等，有待進(jìn)一步提高改進(jìn)。