蔣豆豆，董佳文*，胡德勝，周亞娟

0 引言

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我國以及東南亞地區(qū)常見的頭頸部惡性腫瘤之一，死亡率約為1.74/100 000[1]。鼻咽癌治療后復(fù)發(fā)病例占治療失敗病例的30%，復(fù)發(fā)的鼻咽癌往往具有腫瘤乏氧[2]、腫瘤侵襲能力增強、治療前貧血[3]等更加惡劣的病理學(xué)表現(xiàn)，從而加大復(fù)發(fā)后的治療難度。研究表明，鼻咽癌復(fù)發(fā)患者5年內(nèi)生存率僅為30%[4]。乏氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia induce factor-1α,HIF-1α）是機體應(yīng)對乏氧的主要效應(yīng)因子，已經(jīng)被證實與腫瘤缺氧、侵襲能力增強等細胞生物學(xué)行為密切相關(guān)[5]。程序死亡受體-配體1（programmed death ligand 1,PD-L1）是程序性死亡受體1（programmed death 1,PD-1）的配體之一，可以抑制T細胞的活化，誘導(dǎo)腫瘤患者體內(nèi)T細胞凋亡從而導(dǎo)致腫瘤細胞免疫逃逸[6]。臨床研究表明在口腔癌和肺癌中PD-L1的表達與HIF-1α有關(guān)[7-8]。因此，乏氧誘導(dǎo)的鼻咽癌惡化很可能與HIF-1α調(diào)節(jié)PD-L1的表達相關(guān)，但具體調(diào)控機制尚未明確。本實驗以鼻咽癌細胞為研究對象，通過在乏氧條件下沉默HIF-1α基因，檢測細胞增殖和細胞凋亡率，研究了乏氧條件下鼻咽癌中HIF-1α對于鼻咽癌細胞生物學(xué)行為的影響，并且初步探討鼻咽癌細胞中HIF-1α通過上調(diào)PD-L1促進鼻咽癌惡性發(fā)展的相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人類鼻咽癌細胞系CNE2（低分化癌），由中山腫瘤防治中心贈予。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗?jié)饪s液（×100）、無血清培養(yǎng)基Opti-MEM、胰酶（Trypsin-EDTA）購自美國Gibco公司；核糖核酸酶抑制劑、MTT細胞增殖檢測劑購自美國Sigma公司；Triton-X 100購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HIF-1α小鼠單克隆抗體（93kD）、STAT3兔單克隆抗體（88kD）、PSTAT3兔單克隆抗體（88kD）、PD-L1兔單克隆抗體（40～45kD）、兔多抗GAPDH（37kD）均購自英國Abcam公司；RNA提取試劑TRIzol reagent、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Master Mix試劑盒購自加拿大Fermentas公司；siRNA及PCR目標基因引物的合成由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

采用10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的CNE2細胞，進行細胞計數(shù)，并以每孔2×105個細胞接種于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)常氧組、乏氧組、HIF-1α-siRNA+乏氧組、NC-siRNA+乏氧組四組進行實驗。常氧組的細胞在20%O2中培養(yǎng)，乏氧組在1%O2中培養(yǎng)，HIF-1αsiRNA+乏氧組的細胞在1%O2中培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA，NC-siRNA+乏氧組在1%O2中培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染NC-siRNA。按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，將根據(jù)HIF-1α序列設(shè)計篩選的HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染至CNE2細胞，同時另設(shè)一組CNE2細胞轉(zhuǎn)染無意義的干擾序列NCsiRNA作為對照。培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗，轉(zhuǎn)染序列見表1。

表1 轉(zhuǎn)染序列Table 1 Transfection sequence

1.4 RNA提取與PCR定量檢測

按照不同的條件處理細胞以后，棄去培養(yǎng)基停止培養(yǎng)，加入TRIzol提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，于凝膠成像儀中成像。同時按照熒光定量PCR試劑盒說明書檢測mRNA水平。反應(yīng)條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。引物序列見表2。最終數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進行分析（檢測siRNA敲低效率）。通過RT-PCR檢測HIF-1α、PD-L1及STAT3分子的mRNA表達水平。

表2 引物序列及擴增片段長度Table 2 Primer sequence and amplified fragment length

1.5 MTT測定細胞增殖率

將各組細胞按照不同條件處理后，棄去培養(yǎng)基終止培養(yǎng)后，用0.25%的胰酶消化，按照每孔5×104個/毫升接種至96孔板，按照不同條件培養(yǎng)過夜后，每孔加入10 μl MTT，37℃孵育4 h后，加入150 μl DMSO，最后用酶標儀測量568 nm波長處的OD值，細胞存活率（%）=（實驗組OD均值/對照組OD均值）×100%。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

將各組不同細胞按不同條件處理后，48 h收集各組細胞，按AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測，加入Bind Buffer混勻，反應(yīng)15 min后加入Annexin-APC檢測試劑混勻，最后上流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達

按照不同條件處理細胞各組細胞后，棄去培養(yǎng)基終止培養(yǎng)，每皿加入100 μl細胞裂解液（PMSF∶裂解液=1∶100）裂解細胞，冰上裂解 30 min后收集裂解的細胞，按照BSA試劑盒測量提取的蛋白濃度。將提取的蛋白用5×蛋白上樣緩沖液混合后，在沸水中煮沸變性。樣品用10%分離膠或者8%分離膠以及5%濃縮膠進行電泳分離，電轉(zhuǎn)、封閉之后，4℃孵育一抗過夜（GADPH∶ 1∶1 000，STAT3∶ 1∶1 500,PSTAT3∶ 1∶200 000,HIF-1α∶ 1∶1 000,PD-L1∶ 1∶1 000），第二日用HRP標記羊抗兔二抗室溫孵育2 h，最后用凝膠成像儀成像，BandScan5.0分析膠片灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行分析；雙側(cè)檢驗P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乏氧條件下及沉默HIF-1α基因后CNE2細胞的增殖變化

我們針對H I F-1 α 設(shè)計合成了三條不同的siRNA序列，篩選出其中敲低效率最高的一條，即HIF-1α-siRNA-2進行后續(xù)實驗，見圖 1A。MTT實驗結(jié)果顯示乏氧條件下細胞增殖率顯著大于常氧組（均P=0.000），見圖1B。與常氧組相比，HIF-1α-siRNA+乏氧顯著降低了細胞增殖率（P=0.000）；與NC-siRNA+乏氧組相比，HIF-1α-siRNA+乏氧也顯著降低了細胞增殖（P=0.000）。由此可得，乏氧條件下HIF-1α在CNE2的細胞增殖中發(fā)揮了重要作用。

圖1 轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA后CNE2細胞對HIF-1α基因的沉默效率(A)和MTT檢測不同處理條件下CNE2細胞的增殖水平(B)Figure 1 Silencing efficiency of HIF-1α in CNE2 cells(A) and proliferation of CNE2 cells under different treatment conditions detected by MTT(B)

2.2 乏氧條件下及沉默HIF-1α基因后CNE2細胞的凋亡變化

流式細胞術(shù)顯示，乏氧條件下細胞凋亡率與常氧培養(yǎng)條件下細胞凋亡率無明顯差異。相比于乏氧組的細胞，乏氧條件下轉(zhuǎn)染HIF-1α-siRNA后顯著增加了細胞凋亡率（P=0.000）。此外，HIF-1α-siRNA+乏氧組的細胞凋亡率也明顯大于NC-siRNA+乏氧組（P=0.001），見圖2。實驗結(jié)果提示靶向沉默HIF-1α基因能夠促進人鼻咽癌細胞CNE2的凋亡。

圖2 流式細胞術(shù)檢測不同處理條件下CNE2細胞的凋亡水平Figure 2 Apoptosis of CNE2 cells under different treatment conditions detected by flow cytometry

2.3 乏氧條件下及沉默HIF-1α基因后HIF-1α、PD-L1及STAT3 mRNA表達水平的變化

RT-PCR檢測顯示，乏氧組的HIF-1α mRNA水平顯著高于常氧組（P=0.004），HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染后CNE2細胞HIF-1α mRNA水平顯著下降，顯著低于乏氧組（P=0.000）和NC-siRNA+乏氧組（P=0.000），顯示轉(zhuǎn)染成功，見圖3。HIF-1α-siRNA+乏氧組的PD-L1 mRNA水平顯著低于乏氧組（P=0.000）和NC-siRNA+乏氧組（P=0.000），顯示HIF-1α mRNA水平與PD-L1 mRNA水平呈正比。此外，乏氧組的STAT3 mRNA表達水平相比常氧組顯著上升（P=0.009），HIF-1α-siRNA+乏氧組的STAT3 mRNA水平顯著低于乏氧組（P=0.001）和NC-siRNA+乏氧組（P=0.001），見圖4。結(jié)果表明HIF-1α mRNA水平與PD-L1 mRNA水平成正相關(guān)，且STAT3可能是HIF-1α正性調(diào)控PD-L1的關(guān)鍵信號因子。

圖3 RT-PCR檢測CNE2細胞中HIF-1α、PD-L1及STAT3的表達Figure 3 HIF-1α,PD-L1 and STAT3 expression in CNE2 cells detected by RT-PCR

圖4 不同條件下CNE2細胞中HIF-1α(A)、PD-L1(B)及STAT3(C)mRNA表達水平的變化Figure 4 HIF-1α(A),PD-L1(B) and STAT3(C) mRNA expression in CNE2 cells under different conditions

2.4 乏氧條件下及沉默HIF-1α基因后HIF-1α、PD-L1、STAT3和pSTAT3蛋白的表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，乏氧組的HIF-1α蛋白水平顯著高于常氧組（P=0.004），HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染后的CNE2細胞HIF-1α分子蛋白水平顯著下降，顯著低于乏氧組（P=0.001）和NC-siRNA+乏氧組（P=0.001）。同時，HIF-1α-siRNA+乏氧組的PD-L1蛋白水平顯著低于乏氧組（P=0.017）和NC-siRNA+乏氧組（P=0.0017），顯示HIF-1α分子蛋白水平與PD-L1蛋白水平成正比。此外，相比常氧組，乏氧組的STAT3和pSTAT3蛋白表達水平均顯著上升（P=0.011），HIF-1α-siRNA+乏氧組的STAT3蛋白水平顯著低于乏氧組（P=0.009）和NCsiRNA+乏氧組（P=0.001），HIF-1α-siRNA+乏氧組的pSTAT3蛋白水平顯著低于乏氧組和NCsiRNA+乏氧組（均P＜0.001），見圖5～6。實驗結(jié)果表明，乏氧條件下，隨著HIF-1α誘導(dǎo)PD-L1的高表達，STAT3磷酸化水平也增加。反之，HIF-1α的靶向沉默抑制了PD-L1的表達和STAT3磷酸化水平。我們認為HIF-1α誘導(dǎo)PD-L1表達上調(diào)可能通過活化STAT3實現(xiàn)。

圖5 Western blot檢測CNE2細胞中HIF-1α,PD-L1,STAT3及pSTAT3蛋白的表達Figure 5 HIF-1α,PD-L1,STAT3 and pSTAT3 protein expression in CNE2 cells detected by Western blot

3 討論

鼻咽癌是我國最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)的治療方法難以根治。乏氧在腫瘤微環(huán)境中非常常見，且能影響惡性腫瘤的生理狀況。HIF-1α是乏氧環(huán)境下調(diào)控基因的重要轉(zhuǎn)錄因子[8]。研究表明，HIF-1α在包括乳腺癌[9]、鼻咽癌及結(jié)腸癌等多種人類腫瘤中過度表達，且HIF-1α高表達往往與惡性腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)。有研究證明原花青素可以通過降低HIF-1α從而抑制鼻咽癌細胞生長[10]。然而，HIF-1α在鼻咽癌中的具體機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，乏氧組HIF-1α高表達下的高增殖率和低凋亡率可被siRNA-HIF-1α轉(zhuǎn)染有效逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果證明HIF-1α表達可以促使乏氧條件下鼻咽癌的惡性進展。

隨著免疫治療的發(fā)展，PD-L1的表達水平與鼻咽癌發(fā)展開始得到密切關(guān)注。PD-L1往往在腫瘤細胞表面高表達，通過與PD-1的結(jié)合抑制T細胞活化，促進腫瘤細胞免疫逃逸。研究表明乏氧條件下HIF-1α可能通過調(diào)節(jié)PD-L1，造成腫瘤細胞免疫耐受，促進癌癥惡性發(fā)展[11-14]。最新研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌白人患者中腫瘤細胞上PD-L1表達與不良結(jié)果相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細胞中HIF-1α的表達與PD-L1的表達呈顯著正相關(guān)。除此之外，乏氧條件下，鼻咽癌細胞中STAT3 mRNA和蛋白水平顯著高于常氧組，而轉(zhuǎn)染siRNA-HIF-1α逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，同時降低了STAT3的磷酸化水平。已有研究報道STAT3是介導(dǎo)PD-L1表達的調(diào)控因子[16]，而伊卡利汀可以通過抑制STAT3磷酸化抑制鼻咽癌細胞CNE2的增殖、遷移和侵襲[17]。因此，PD-L1可能是乏氧誘導(dǎo)鼻咽癌惡性進展的重要原因，并且涉及STAT3的活化，這與Xing等[18]研究結(jié)論一致。

圖6 不同條件下CNE2細胞中HIF-1α(A)、PD-L1(B)、STAT3(C)及pSTAT3(D)蛋白表達水平的變化Figure 6 HIF-1α(A),PD-L1(B),STAT3(C) and pSTAT3(D) proteins expression in CNE2 cells under different conditions

PD-L1免疫治療可能給鼻咽癌治療帶來新的治療策略。PD-L1抗體阿特珠單抗，Durvalumab已可以用來治療非小細胞肺癌和膀胱癌[19]。PD1免疫抑制劑聯(lián)合化學(xué)療法作為轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的一線治療可以緩解91%患者的病情，34%復(fù)發(fā)鼻咽癌患者的病情[20]，IFNβ和抗PD-1的組合可以增強NK細胞對鼻咽癌細胞的細胞毒性[21]，但是尚未有臨床報導(dǎo)PD-L1抑制劑對鼻咽癌的治療作用。

PD-L1是鼻咽癌患者預(yù)后的獨立影響因素[22]，結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在免疫耐受中的調(diào)控作用將會給鼻咽癌治療帶來新的方向，PD-L1有望為鼻咽癌免疫療法提供新的分子靶標。另外，本研究在評估PD-L1的表達與臨床鼻咽癌患者的相關(guān)性，驗證PD-L1抑制劑對鼻咽癌的治療作用等實驗方面還待展開，如何使鼻咽癌免疫治療更優(yōu)化，需要我們結(jié)合更多的實驗和大數(shù)據(jù)分析，進一步探索PD-L1影響鼻咽癌的相關(guān)機制，考察以PD-L1為靶點的治療方案。