殷怡帆，羅朵生＊＊，郭 姣

（1.廣東藥科大學廣東省代謝病中西醫(yī)結合研究中心 廣州 510006；2.廣東藥科大學廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室 廣州 510006）

胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）是指胰島素促進葡萄糖攝取的作用降低而胰島素的補償性分泌增加的狀態(tài)，與非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病密切相關[1]。人參是五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根及根莖，中藥人參制劑對胰島素抵抗干預效應的Meta分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用中藥人參制劑能顯著改善胰島素抵抗和血糖水平[2]，但其具體機制尚不明確。因此，進一步闡明人參改善胰島素抵抗作用的藥效成分及作用機制對擴大人參應用范圍、開發(fā)防治胰島素抵抗藥物具有重要意義。但人參成分復雜，作用靶點較多，如何闡明其多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)的作用特點是目前面臨的瓶頸問題之一。

利用計算機科學、分子生物學、藥學等學科的成果，網(wǎng)絡藥理學可以全面闡明中藥多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)的功能特點。本研究采用UPLC-TOF-MS分析人參化學成分，結合網(wǎng)絡藥理學方法，解析人參改善IR的潛在活性成分、作用靶點及機制，以期為非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病臨床干預治療提供新的思路。

1 儀器與材料

超高效液相色譜分析系統(tǒng)（Agilent公司，美國），高分辨四級桿與飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent公司，美國）、C18色譜柱（ACQUITY UPLC CSH，2.1 mm×100 mm，1.7μm），超聲波清洗器（DL-360A，50 Hz，400 W，上海之信儀器有限公司），低溫高速離心機（FRESCO17，Thermo公司，美國），甲醇，乙腈（Merck公司，德國），超純水（屈臣氏），人參（購自長白工坊科貿(mào)有限公司）[3]。

2 方法

2.1 化學成分分析

稱取人參藥材粉末0.3 g，加入50 mL 60%甲醇溶液，超聲提取1 h，離心5 min（轉(zhuǎn)速12000 rpm，溫度20℃），取上清液待測。進樣量：5μL；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40℃；二元梯度洗脫，流動相A為水，B為乙腈；梯度洗脫條件如下（表1）。質(zhì)譜條件參考文獻報道[4]，質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）：毛細管電壓（capillary):2800 V，錐孔電壓（samplecone)：20 V，離子源 溫（source temperature)：100℃，脫 溶 劑 溫 度（desolvation temperature)：350℃，脫溶劑N2體積流量為500 L/h，錐孔反吹N2體積流量為50 L/h，脫溶劑氣為N2，碰撞氣體為Ar。

表1 超高效液相梯度洗脫分析人參的條件

根據(jù)質(zhì)譜所得，結合文獻報道，通過分析化合物的準確分子量，篩選出人參的主要化學成分。

2.2 活性成分靶點預測

具體預測流程參考本團隊的報道[3]，概述如下：將上述獲得成分上傳至PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中查詢SMILES號。將獲得的SMILES號上傳至Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch），點擊預測成分作用靶點即可進行分析，輸出化合物靶點信息。把靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/uploadlists）中，進行批量標準化審核（物種選擇 “Homo Sapiens” ）。將審核得到的人參主要活性成分的靶點與CTD數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org）、GeneCards（https://www.genecards.org）中胰島素抵抗有關的作用靶點進行對比，篩選潛在靶點。

2.3 疾病靶點關系網(wǎng)絡構建

將靶點導入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），選擇多種蛋白質(zhì)進行分析，物種選擇為 “Homo Sapiens” ，得到蛋白相互作用關系；將相關數(shù)據(jù)導入到Cytoscape軟件中，根據(jù)分值和節(jié)點度值設置節(jié)點和邊緣的大小、顏色和粗細，得到目標蛋白互作網(wǎng)絡圖。

2.4 生物學功能和通路分析

將篩選出的人參改善胰島素抵抗作用潛在靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進行生物學過程和通路分析。將來源于數(shù)據(jù)庫DAVID的富集分析結果導入數(shù)據(jù)庫imageGP，然后使用插件 “MCODE” 對分析結果的生物過程進行聚類分析。

2.5 人參活性成分靶點通路關系網(wǎng)絡構建

將上述獲得人參活性成分、疾病靶點、作用通路數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.6.1軟件中構建人參活性成分靶點通路關系網(wǎng)絡圖。

2.6 分子對接驗證

具體對接驗證流程參考本團隊的報道[3]，概述如下：選擇人參活性成分靶點通路關系網(wǎng)絡圖中節(jié)點度值排行前4的疾病靶點，從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載3D結構，并用AutoDock軟件移除水分子和配體后保存為PDBQT文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫下載人參成分2D結構，利用PyRx軟件最小化其能量后也保存為PDBQT文件，運用Vina對接，配體與受體可自發(fā)結合時其結合能小于0。

3 結果

3.1 人參化學成分

超高效液相色譜四極桿飛行時間混合質(zhì)譜（Ultra performance liquid chromatography quadrupole-time-offlight hybrid mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）是一種高分辨率的選擇性靈敏技術，適用于復雜藥物活性成分分析。本文采用UPLC-Q-TOP-MS分析人參的化學成分，結果顯示主要有52個色譜峰（圖1），通過化合物m/z信息，并結合文獻對比，得到41個已知化合物（表2）。

表2 人參化學成分表

圖1 人參化學成分分析總離子流圖

3.2 人參活性成分靶點信息

將潛在活性成分的SMILES信息上傳到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，得到4350個靶點，經(jīng)過篩選去重后得到667個靶點。將靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫中進行批量標準化，下載審核過的614個靶點。在疾病數(shù)據(jù)庫搜索與IR相關的靶點，對比得到26個改善IR的潛在作用靶點，主要包括AKT1、AKT2、ALB、BCL2、CASP3等（表3）。

表3 化學成分潛在靶點

3.3 疾病靶點關系網(wǎng)絡構建

通過String數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點關系網(wǎng)絡圖（圖2）。該網(wǎng)絡圖中包含有26個靶點、198條邊，度值越大，節(jié)點顏色大小越顯著，而綜合得分數(shù)值越大，邊顏色越深、越粗。圖中節(jié)點度值較大的蛋白質(zhì)為AKT1、MAPK3、MAPK1、PPARG、VEGFA，表明人參改善IR可能通過多個靶點聯(lián)合共同發(fā)揮作用。

圖2 疾病靶點關系網(wǎng)絡圖

3.4 生物學功能注釋

人參改善IR潛在靶點GO生物學功能分析表明，GO分析有3個分支，為生物過程、細胞組分和分子功能。在氣泡圖右側(cè)用圓形、三角形和正方形分別表示生物過程、細胞組分和分子功能。Qvalue值表示富集的顯著性，顏色由綠到紅顯示，富集程度越高，顏色越紅，Qvalue值越大。氣泡的大小則顯示富集到此生物學功能的基因數(shù)量，富集的基因數(shù)量越多，氣泡越大。結果顯示（圖3），人參在改善胰島素抵抗的生物過程中主要富集到積極調(diào)控細胞遷移，對內(nèi)源性刺激的反應，對激素刺激的反應，對有機物質(zhì)的反應，高分子代謝過程的正調(diào)控等；細胞組分富集到細胞外空間、胞質(zhì)溶膠、微粒體、囊泡分數(shù)等；分子功能中富集到胰島素受體底物結合、類固醇激素受體活性胰島素樣生長因子結合、配體依賴性核受體活性等生物學過程。

圖3 GO富集圖

生物分子主要通過相互作用模塊組成的分子網(wǎng)絡工作[22]，因此有必要對GO生物過程進行模塊分析，根據(jù)MCODE聚類分析算法篩選出9個K-Core≥2的聚類模塊（圖4），其中生物過程越重要，連接節(jié)點的邊就越多，節(jié)點越大。依次是脂質(zhì)代謝過程、離子穩(wěn)態(tài)、生物種間相互作用、免疫系統(tǒng)過程、多細胞生物繁殖、核膜組織、分子功能的正調(diào)控/轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)蛋白運輸?shù)恼{(diào)節(jié)、脂肪酸代謝過程等生物過程。

圖4 潛在靶點GO生物過程模塊分析子簇圖

3.5 靶點通路注釋分析

有20條通路被富集，主要涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)：胰島素信號通路（Insulin signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、T細胞受體信號通路（Tcell receptor signalingpathway）、B細胞受體信號通路（Bcell receptor signalingpathway）、FcεRI信號通路（Fc epsilon RIsignaling pathway）；物質(zhì)代謝：mTOR信號通路（mTOR signaling pathway）；神經(jīng)系統(tǒng)：神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路（Neurotrophin signaling pathway）；II型糖尿病、癌癥等（圖5）。表明人參改善胰島素抵抗的靶點分布在多條通路中，從而協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。

圖5 靶點通路富集分析

3.6 人參活性成分靶點通路關系網(wǎng)絡圖

構建的成分靶點通路關系網(wǎng)絡圖中有87個節(jié)點，包括41種成分、26個靶點、20條通路和361條邊（圖6）。節(jié)點度值越大，說明與其相連的節(jié)點數(shù)越多，產(chǎn)生作用越大。其中人參二醇、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rh7和人參二酮等節(jié)點度值較大，表明其作用靶點多。圖中MAPK1、VEGFA、PIK3R1、NR3C1、JUN等靶點節(jié)點較大，可能成為藥物作用的靶點。癌癥、FcεRI信號通路、II型糖尿病等通路的節(jié)點較大，表明人參改善胰島素抵抗與上述相關通路有關。

圖6 人參活性成分靶點通路關系網(wǎng)絡圖

3.7 分子對接

選擇圖6中度值排名前4的靶點MAPK1（PDBID：6SLG）、VEGFA（PDB ID：5DN2）、PIK3R1（PDB ID：5GJI）、NR3C1（PDBID：5E69）與度值較大的19種成分進行對接（表4）。分子對接的結合能越小，說明活性成分與靶點的結合活性越高。結果顯示，與MAPK1結合能最低的化合物為25-羥基原人參二醇（結合能為-7.9 kJ·mol-1），與VEGFA結合能最低的化合物為人參皂苷Rd（結合能為-9.5 kJ·mol-1），與PIK3R1結合能最低的化合物為人參皂苷Rg1（結合能為-7.7 kJ·mol-1），與NR3C1結合能最低的化合物為人參二酮（結合能為-8.1 kJ·mol-1）。以結合能≤-5.0 kJ·mol-1為篩選標準，人參中主要化學成分與主要靶點MAPK1、VEGFA、PIK3R1、NR3C1的結合能均小于-5.0 kJ·mol-1。由此可見，人參的主要化學成分與胰島素抵抗疾病蛋白形成構象能量低，結構穩(wěn)定，結合活性較高。

表4 分子對接結果

4 討論

以 “人參” 為關鍵詞，通過CNKI檢索2009年-2019年發(fā)表的文獻共計有5627篇，可見人參是研究熱點。以往對人參藥效學及作用機制的研究多集中在免疫調(diào)節(jié)、心腦血管病等領域，如抗疲勞、心肌缺血、動脈粥樣硬化等，對人參改善胰島素抵抗的網(wǎng)絡藥理學研究尚未見報道。胰島素抵抗是非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)，而人參可顯著改善胰島素抵抗和血糖水平，但其具體機制尚不明確，使人參應用于代謝性疾病治療的作用未得到充分發(fā)揮。因此，為推動人參治療代謝性疾病的藥效物質(zhì)基礎和作用機制研究，本研究對實驗結果進行探討。

4.1 人參改善IR活性成分

結合圖6，本研究中發(fā)現(xiàn)人參二醇、人參二酮、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rc、人參皂苷RD、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1等主要成分參與改善胰島素抵抗。人參皂苷主要分為人參二醇皂苷和人參三醇皂苷，兩者構型不同，但可協(xié)同發(fā)揮作用[23]。

人參二醇型皂苷主要包括人參皂苷Rb1、Rk1、Rg3、Rg5等。研究發(fā)現(xiàn)人參二醇型皂苷可顯著降低2型糖尿病大鼠游離脂肪酸水平，改變細胞膜流動性促進胰島素結合，降低肝糖原分解，從而改善胰島素抵抗[24]。將50μmol·L-1人參皂苷Rk1和Rg5混合物作用于3T3-L1胰島素抵抗細胞模型，能有效增加該細胞對葡萄糖的攝取，改善胰島素抵抗[25]。人參皂苷Rg3糖苷能升高db/db糖尿病大鼠血液中胰島素含量，降低血糖[26]。人參皂苷Rb1能上調(diào)PPARG的表達，增加葡萄糖向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運從而改善胰島素抵抗[27]。

人參三醇型皂苷主要包括人參皂苷Re、Rg1等。人參皂苷Re通過減輕胰島素刺激引起的GLUT4易位損傷，迅速改善高脂飲食大鼠肌肉的胰島素抵抗[28]。人參皂苷Rg1能降低糖尿病大鼠肝組織TLR4蛋白陽性細胞百分比，抑制氧化應激反應，降低血糖水平[29]。

因此，本研究將UPLC-TOF-MS與網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合，能夠間接預測人參改善胰島素抵抗的活性成分，為其有效成分篩選提供參考。

4.2 人參改善IR潛在作用靶點

分析靶點蛋白互作網(wǎng)絡圖可見，c-Jun氨基末端激酶（JNK）、蛋白激酶B 1（AKT1）、磷脂酰肌醇-3激酶受體1（PIK3R1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（PPARG）等靶點是胰島素抵抗互作網(wǎng)絡中主要靶點。JNK的缺失對肥胖引起的胰島素抵抗產(chǎn)生保護作用，炎癥因子TNF-α和FFAs4濃度升高激活JNK，進而磷酸化Ser 307處的IRS-1，這是肥胖引起的胰島素抵抗的關鍵因素[30]。激活PI3K-Akt信號通路，活化的AKT調(diào)節(jié)Fox O1和GSK3等一系列下游分子，增加糖原的生成，調(diào)控脂肪酸合成基因及糖異生基因的表達。同時也有研究發(fā)現(xiàn)增加GLUT4蛋白表達，有效降低AKT1對胰島素信號傳導的負反饋調(diào)節(jié)，從而增加葡萄糖的利用率，提高細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運能力，改善胰島素抵抗[31,32]。VEGFA的轉(zhuǎn)錄因子miRNA-93過表達，與GLUT4 3'UTR末端位點結合，抑制GLUT4蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯和表達，降低胰島素敏感性[33]。PPARG是脂肪細胞基因表達和胰島素細胞間信號轉(zhuǎn)導的主要調(diào)節(jié)者，介導細胞內(nèi)胰島素信號轉(zhuǎn)導，參與脂肪細胞分化和糖脂代謝的調(diào)節(jié)[34]。因此，JNK、AKT1、PIK3R1、VEGFA、PPARG與改善胰島素抵抗機制密切相關。

本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、原人參三醇和人參皂苷Re等成分可與VEGFA、PIK3R1、JUN、PPARG等靶點互相作用，提示這些成分為人參改善胰島素抵抗的關鍵活性成分。本研究通過網(wǎng)絡藥理學預測出人參改善胰島素抵抗的潛在作用靶點，為后期進一步研究人參改善IR的作用機制提供啟示。

4.3 人參改善IR分子機制

本研究發(fā)現(xiàn)人參改善IR作用與mTOR信號傳導通路、Toll樣受體信號傳導通路和胰島素受體通路等關系密切。

4.3.1 mTOR信號傳導通路

mTOR信號通路是PI3K/AKT的重要下游通路，在IR中發(fā)揮重要作用。胰島素與靶細胞的胰島素受體結合后磷酸化其受體底物的酪氨酸殘基，使PI3K/Akt信號通路激活，增加肝臟、肌肉、脂肪等組織對葡萄糖的攝取。當機體糖代謝紊亂時，循環(huán)中的高糖毒性會過度激活靶細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號通路，引起泛素-蛋白酶系統(tǒng)降解IRS1和IRS2，加重胰島素抵抗[35]。

4.3.2 Toll 4受體信號

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）是一種單跨膜非催化蛋白，能識別突破皮膚、粘膜等身體物理屏障的微生物，并激活身體產(chǎn)生免疫細胞反應。在非特異性免疫和特異性免疫中均發(fā)揮重要作用。最新研究表明，TLR4信號通路激活后，可通過MyD88信號通路激活NF-κB通路，啟動多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，介導機體的炎癥反應，最終導致組織器官損傷[36]。

4.3.3 胰島素通路

已有文獻報道PIK3R1和PPARG與葡萄糖轉(zhuǎn)運、胰島素敏感性等密切相關。路鑫鑫等[37]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷通過增加PI3K的表達，從而上調(diào)PI3K信號通路來逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗，而PI3K-AKT通路為胰島素受體通路的主要下游信號通路。PPARG主要對脂類進行分解代謝，除此以外還與多種疾病如糖尿病、動脈硬化和癌癥等相關，人參皂苷Rb1直接激活PPARG，對胰島素信號傳導途徑具有直接作用[27]。

綜上，本文首先采用UPLC-TOF-MS分析人參主要化學成分，然后運用網(wǎng)絡藥理學的方法解析其改善IR作用的可能靶點及機制，并通過分子對接技術進一步驗證，發(fā)現(xiàn)人參的主要活性成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、人參二酮和25-羥基原人參二醇等活性成分作用于MAPK1、VEGFA、PIK3R1、NR3C1等多個靶點，參與脂質(zhì)代謝、離子穩(wěn)態(tài)、免疫系統(tǒng)等生物過程，調(diào)節(jié)mTOR信號傳導通路、Toll樣受體信號傳導通路和胰島素受體通路從而發(fā)揮改善胰島素抵抗作用，為進一步開展系統(tǒng)的人參改善胰島素抵抗作用機制研究和臨床開發(fā)應用提供理論依據(jù)。同時，也為下一創(chuàng)新性研究提供線索和啟示。

本研究也存在一些不足。受限于數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的全面性，獲得的靶點可能不夠精確，如能對預測的活性成分和靶點進一步驗證將更有說服力。