劉昌順，夏 婷，魏小涵，陳飛龍，譚曉梅

（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省中藥制劑技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室 廣州 510515）

葛根芩連湯（Gegen Qinlian Decoction，GQD）為《傷寒論》經(jīng)典方劑，具解表清里、升清止利之功，治療協(xié)熱下利證，臨床上對感染性腹瀉療效突出。研究表明GQD具解熱、抗炎、抗菌和止瀉等作用[1]，其藥效物質(zhì)主要為黃酮類和生物堿類成分[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)GQD部分功效成分在腹瀉和正常小型豬體內(nèi)藥動學(xué)存在差異[3]，推測這可能與腹瀉腸道改變對藥物的處置有關(guān)，然而這種差異是否會隨著治療持續(xù)和機(jī)體康復(fù)而逐漸消失，仍不清晰。短鏈脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs）是腸道菌群代謝產(chǎn)物，能促進(jìn)腸道水和電解質(zhì)的吸收，維持腸道生理和穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)免疫等作用[4]，是反映機(jī)體整體代謝輪廓和腸道健康狀態(tài)的重要指標(biāo)，已成為腹瀉診斷的重要生物標(biāo)志物，其含量變化可反映藥物對腹瀉機(jī)體的療效進(jìn)程[5]。本文通過研究GQD給藥期間其主要功效成分在腹瀉小型豬體內(nèi)藥動學(xué)的變化過程及其對血清SCFAs的影響，從機(jī)體對藥物的反應(yīng)及腹瀉標(biāo)志物水平變化的角度，動態(tài)揭示GQD對腹瀉的作用。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

UPLC-MS/MS儀（Agilent1290 Infinity-G6410美國安捷倫公司），GC-MS儀（TRACE1300-ISQ美國賽默飛公司），HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BP211D型十萬分之一天平（德國Sartorius）。

1.2 試劑

葛 根（Puerarialobata(Willd.)Ohwi；批 號171000721，產(chǎn)地安徽），黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi；批號171003251，產(chǎn)地河北），黃連（Coptis chinensis Franch.；批號171103221，產(chǎn)地四川）和炙甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.；批號161108681，產(chǎn)地內(nèi)蒙古）購于康美藥業(yè)股份有限公司，以上藥材由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院晁志教授鑒定。葛根素，大豆苷，大豆苷元，黃芩苷，黃芩素，漢黃芩苷，漢黃芩素，鹽酸小檗堿，鹽酸巴馬汀，鹽酸黃連堿，柚皮苷（GQD成分檢測內(nèi)標(biāo)，IS），乙酸，丙酸，丁酸和2-乙基丁酸（SCFAs檢測IS）對照品，均購于中國藥品生物制品檢定所。色譜級別甲醇和乙腈購于德國默克公司，水，甲酸，以及其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

2 試驗(yàn)方法

2.1 GQD水煎液的制備

參考課題組前期研究制備GQD水煎液[6-7]，稱取15 g葛根，在400 mL冷水中浸泡30 min后，加熱保持微沸20 min，隨后加入9 g黃連，9 g黃芩和6 g甘草一起煎煮10 min，2層紗布過濾后，藥渣加入300 mL水再次煮沸30 min，藥液2層紗布過濾后與第1次水煎液合并。將水煎液濃縮至0.3 g·mL-1生藥量。水煎液適量稀釋后對其主要功效成分進(jìn)行含量檢測，得到如下分析結(jié)果：7.05 mg·mL-1葛根素，0.90 mg·mL-1大豆苷，0.01 mg·mL-1大豆苷元，1.03 mg·mL-1黃芩苷，0.04 mg·mL-1黃芩素，0.77 mg·mL-1漢黃芩苷，0.02 mg·mL-1漢黃芩素，0.18 mg·mL-1小 檗 堿，0.04 mg·mL-1巴 馬 汀 和0.10 mg·mL-1黃連堿。

2.2 動物實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為正常組和模型組（n=6），每組雌雄各半。按本課題前期研究進(jìn)行造模[6-7]，模型組乳豬灌胃大腸桿菌液（E-coli；109CFU·kg-1），若連續(xù)腹瀉超過6 h，且糞便E-coli含量大于1011CFU·g-1濕便，說明造模成功。動物實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。動物均口服GQD（1.22 g·kg-1）。分別于0 h、24 h、48 h和72h給予GQD，然后分別于3 h、12 h、24 h、27 h、36 h、48 h、51 h、60 h、72 h、75 h、84 h和96 h在小型豬前腔靜脈采血0.75 mL各2份，一份用肝素鈉抗凝后離心（4℃，5000 rpm，10 min）得到血漿，另1份直接離心獲得血清，-20℃保存待測，其中在24 h、48 h和72 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血完成立即進(jìn)行給藥。

2.3 樣品處理

2.3.1 GQD成分檢測樣品處理

取血漿樣品100μL，精密移取IS工作溶液20μL加入血漿樣品，震蕩30 s，加入100μL 0.2%稀鹽酸，震蕩30 s，加入800μL乙酸乙酯-正丁醇（2∶1，v/v）溶液，震蕩3 min，離心（4℃，15000 rpm，10 min），分取上層溶液，再以800μL乙酸乙酯-正丁醇（2∶1，v/v）溶液重復(fù)萃取一次，合并上層溶液，氮?dú)饬飨麓蹈?。殘留物?00μL甲醇復(fù)溶，震蕩2 min，離心（4℃，15000 rpm，10 min），取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測分析。

2.3.2 SCFAs檢測樣品處理

取血清樣品50μL，加100μL甲醇，震蕩2 min，離心（4℃，15000 rpm，10 min），取上清液100μL，加入IS工作液20μL（60μg·mL-1），取上清液進(jìn)行GC-MS分析。

2.4 UPLC-MS/MS分析條件

2.4.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 3-C18column（2.1×100 mm，3μm）；流動相：0.1%的甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫條件如下：0 min-2.5 min：15%-30%B，2.5 min-3.5 min：30%-35%B，3.5 min-5 min：35%-40%B，5 min-9 min：40%-60%B，9 min-11 min：15%-60%B。流速：0.4 mL·min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件

為了能夠?qū)嵭杏∧崛A人民族語言文化教育，熱愛華文教育的老前輩們想方設(shè)法地興辦多種形式的華語教育機(jī)構(gòu)。不過，由于華語只能作為語言課程，在學(xué)校其他主要課程中無法發(fā)揮教學(xué)用語的作用，華文教育的中華文化傳承功能受到嚴(yán)重制約。

離子源：ESI源；毛細(xì)管電壓：4000 V，霧化器壓力：30 psi；干燥氣流溫度：350℃；干燥氣流速度：8.0 L·min-1；碰撞氣微高純氮?dú)?。采集模式：多反?yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）模式。通過前期研究分別采用全掃描、選擇性離子掃描和子離子掃描模式，確定各化合物的母離子和子離子，得到成分及IS的最優(yōu)MRM參數(shù)[8]。

2.5 血漿GQD成分測定方法學(xué)

2.5.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取得10種GQD功效成分對照品適量，甲醇溶解，配制濃度為1.0 mg·mL-1的儲備液。配制對照品混合溶液，稀釋后得到系列濃度的對照品梯度溶液，用空白血漿制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)量控制樣本。

2.5.2 方法學(xué)考察

分別進(jìn)行血漿樣品的專屬性、線性、精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性試驗(yàn)，確認(rèn)分析方法的可行性。分別以空白血漿液，含有對照品的血漿液和實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行方法的專屬性考察。精密移取對照品混合溶液，以分析物濃度為橫坐標(biāo)，各分析物和IS峰面積比值為縱坐標(biāo)，通過回歸運(yùn)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以高、中、低濃度的質(zhì)控樣品液，日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，日間連續(xù)進(jìn)樣3天，以RSD%計(jì)算精密度。質(zhì)控樣品進(jìn)樣后所得峰面積與空白血漿液處理后加相應(yīng)對照品進(jìn)樣所得峰面積相比，計(jì)算回收率。質(zhì)控樣品進(jìn)樣后所得峰面積為分子，對應(yīng)濃度的對照品溶液直接進(jìn)樣后所得峰面積為分母進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。樣品保存24 h后，以RSD%評價(jià)樣品測定的穩(wěn)定性。

2.6 GC-MS檢測血清SCFAs

GC-MS檢測出的血清SCFAs主要為乙酸、丙酸和丁酸色譜峰。所用毛細(xì)管柱為DB-FFAP122-3232，30 m×0.25 mm×0.25μm，載氣為氮?dú)?，流?.2 mL·min-1。初始溫度80℃，保持1 min，以10℃·min-1升溫至170℃，后以20℃·min-1升溫至200℃，保留2 min。檢測器和進(jìn)樣口溫度分別為230℃和200℃，氫氣、空氣、氮?dú)饬魉俜謩e為30 mL·min-1、300 mL·min-1、30 mL·min-1。進(jìn)樣量為1μL，分析時(shí)間為12 min。根據(jù)SCFAs檢測的專屬性試驗(yàn)結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分析血清SCFAs含量。

2.7 數(shù)據(jù)處理

梯形法計(jì)算GQD功效成分各時(shí)間段的藥時(shí)曲線下面積（Area under curve，AUC）。SPSS20.0軟件中的t-test或者ANOVA進(jìn)行組間的差異分析（P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 GQD治療對腹瀉小型豬的影響

給藥GQD后小型豬腹瀉癥狀有所緩解，在48 h腹瀉癥狀基本消失，0 h-96 h，腹瀉小型豬糞便含水量從91.5%±0.9%下降至66.9%±3.5%（P<0.01），與正常組小型豬糞便含水量（64.5%±5.9%）無顯著差異。糞便E.coli數(shù)量從1012.5CFU·g-1濕便下降至1010.2CFU·g-1，而梭菌的數(shù)量則從103.2CFU·g-1濕便提高至106.7CFU·g-1，給藥GQD前后腹瀉小型豬糞便兩種關(guān)鍵菌落的變化具有顯著性差異。

3.2 GQD主要功效成分在血漿樣品的含量測定

專屬性試驗(yàn)表明空白血漿對各成分出峰時(shí)間干擾小，分析物在血漿樣品出峰時(shí)間合適、峰型良好、分離度恰當(dāng)（圖1）。各分析物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.99），且定量下限滿足樣品含量檢測要求（表1）。各成分在低、中、高3種濃度水平質(zhì)控樣品的精密度RSD小于15.0%，說明方法檢測準(zhǔn)確可靠（表2）?；厥章试?8.9%和107.2%之間，基質(zhì)效應(yīng)在82.9%和106.2%之間，提示方法準(zhǔn)確度良好，且檢測過程不受離子效應(yīng)干擾。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明RSD（<15%）符合實(shí)驗(yàn)要求。經(jīng)驗(yàn)證，該方法符合小型豬血漿樣品中10種GQD功效成分的檢測要求，可用于小型豬的藥動學(xué)研究。

表1 GQD功效成分在血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

表2 GQD功效成分在血漿中精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 GQD功效成分在血漿中專屬性試驗(yàn)結(jié)果

3.3 GQD給藥期間主要功效成分藥動學(xué)研究

藥動學(xué)研究表明，給藥GQD后，發(fā)現(xiàn)其主要功效成分在正常和模型小型豬體內(nèi)的藥動學(xué)行為存在顯著差異（圖2）。在0 h-48 h，葛根素、大豆苷元、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素在腹瀉小型豬體內(nèi)的血藥水平顯著高于正常組（P<0.05），在48 h-96 h，這些成分在生理病理機(jī)體的AUC值無顯著差異。0 h-96 h，葛根素、大豆苷、大豆苷元、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素在腹瀉小型豬體內(nèi)每天的最大血藥濃度呈現(xiàn)遞減趨勢，正常組則無此現(xiàn)象（表3）。

圖2 連續(xù)給藥GQD后其功效成分在腹瀉和正常小型豬體內(nèi)的藥時(shí)曲線（n=6）

3.4 GQD給藥對小型豬血清SCFAs的影響

血清SCFAs中，乙酸含量最高，丙酸次之，丁酸最低（圖3）。腹瀉小型豬血清SCFAs顯著低于正常組。隨著給藥GQD時(shí)間的延長，腹瀉小型豬血清中乙酸、丙酸和丁酸的含量逐漸提高，丙酸和丁酸在72 h恢復(fù)至正常水平（P>0.05），乙酸在96 h恢復(fù)至正常。GQD對正常小型豬血清SCFAs含量無顯著影響。

圖3 GQD給藥對腹瀉和正常小型豬血清SCFAs濃度的影響

4 討論

4.1 GQD功效成分的藥動學(xué)特征

前期發(fā)現(xiàn)GQD給藥腹瀉小型豬后3-4天內(nèi)可止瀉，觀察至7天沒有反彈現(xiàn)象[6]，因此本文選擇研究GQD連續(xù)給藥4天內(nèi)的藥動學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)過程中24 h、48 h和72 h采血與給藥時(shí)間重合，為保證前一天的血藥濃度不受后一天給藥干擾，采用先采血后立即給藥的方法進(jìn)行操作。第24 h中黃芩素在模型組的血藥濃度高于正常組，第48 h中黃芩苷在模型組的含量高于正常組，該結(jié)果與AUC結(jié)果相一致，即連續(xù)給藥GQD后，在0 h-48 h，發(fā)現(xiàn)其部分功效成分在腹瀉小型豬體內(nèi)的血藥水平高于正常組（表3），與前期單次給藥結(jié)果一致[3]。血藥水平升高的成分主要為黃酮類成分，由于影響藥物體內(nèi)處置的因素較多，造成這些成分血藥水平提高的原因復(fù)雜，就本研究而言，這可能與腹瀉改變GQD功效成分的腸道處置有關(guān)[9]。前期研究表明，腹瀉腸道可以增加葛根素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的滲透性，促進(jìn)其腸道吸收[10]。黃芩苷可以通過大腸桿菌分泌的糖苷酶代謝為苷元黃芩素，吸收后再轉(zhuǎn)化為原型吸收入血，從而提高黃芩苷和黃芩素血藥濃度[11]。前期發(fā)現(xiàn)腹瀉腸道菌群可以加速GQD糖苷類成分轉(zhuǎn)化為苷元，且腸桿菌是加速其成分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵菌落之一[7]，與本文結(jié)果一致。該證據(jù)同樣部分解釋了腹瀉機(jī)體提高大豆苷元和漢黃芩素血藥水平的原因。48 h-96 h，糞便含水量和E.coli數(shù)量顯著下降，GQD成分在生理病理機(jī)體內(nèi)的AUC值無顯著差異，可能與給藥后小型豬腹瀉癥狀得到改善，腸道微生態(tài)逐漸趨于正常有關(guān)。

表3 連續(xù)給藥后GQD功效成分的AUC值（h·μg·mL-1）

4.2 GQD給藥對血清SCFAs的影響

針對本文細(xì)菌感染性腹瀉模型，腸黏膜炎癥反應(yīng)及其腸黏膜屏障損傷是其主要病理過程，SCFAs作為調(diào)整腸道微生態(tài)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，分子量小易于吸收入血，通過檢測其血內(nèi)含量可以間接觀察方藥對腸道局部的作用。本文結(jié)果表明，GQD給藥在減輕小型豬腹瀉癥狀的同時(shí)，提高了血清SCFAs含量，推測這與GQD調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高腸道SCFAs水平相關(guān)[6]。SCFAs主要由結(jié)腸梭菌類細(xì)菌所產(chǎn)生[12]，本研究表明GQD能提高腸道梭菌含量，降低E.coli數(shù)目，這與血清SCFAs檢測結(jié)果一致[13]，推測GQD給藥抑制條件致病菌E.coli繁殖，從而提高梭菌類細(xì)菌的豐度及其在腸道的定植，促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生，局部改善腸道免疫調(diào)節(jié)和吸收入血發(fā)揮整體抗炎作用[13]。作為腹瀉生物標(biāo)志物，檢測血中SCFAs水平可為臨床腹瀉的診斷提供參考[5]。研究已證實(shí)腸道菌群紊亂是致瀉的關(guān)鍵病因[14]，其代謝產(chǎn)物SCFAs的變化水平可反映腸道菌群乃至腸道的健康狀態(tài)。本文通過血中SCFAs的研究，揭示了GQD對腹瀉的作用及其可能的作用機(jī)制，即通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮止瀉作用。

4.3 GQD成分體內(nèi)過程與SCFAs的聯(lián)系

本研究表明0 h-48 h內(nèi)，GQD中小檗堿血藥水平在腹瀉小型豬體內(nèi)有增加趨勢，但前期組織分布研究發(fā)現(xiàn)GQD生物堿類成分主要分布于腸道組織，吸收進(jìn)入體內(nèi)的含量較低[8]，提示這類成分口服后有利于緩解腹瀉腸道黏膜炎癥反應(yīng)，推測其發(fā)揮藥效的靶點(diǎn)場所可能在腸道，并非吸收入血。課題組前期發(fā)現(xiàn)GQD調(diào)節(jié)腹瀉小型豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的主要功效成分可能與生物堿相關(guān)[6]，以上分析與前期報(bào)道相一致[15]：GQD功效成分小檗堿可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)產(chǎn)SCFAs細(xì)菌的繁殖，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞Th17和Treg的平衡，減輕腸道黏膜免疫炎癥。因此，生物堿類成分可能是GQD提高腹瀉小型豬體內(nèi)SCFAs含量的重要功效成分。此外，鑒于黃芩苷等黃酮類成分良好的抗炎作用[16]，且這類成分在腸道組織同樣具有較高濃度[8]，提示其發(fā)揮藥效的途徑是多環(huán)節(jié)的，即除了吸收入血解熱抗炎之外，還滯留于腸道組織緩解黏膜炎癥反應(yīng)，腹瀉腸道微生態(tài)的調(diào)整可以間接促進(jìn)產(chǎn)SCFAs細(xì)菌在腸道黏膜表面的定植。綜上所述，GQD提高腹瀉小型豬體內(nèi)SCFAs含量可能是其功效成分群綜合作用的結(jié)果，然而方藥中具體哪些成分與SCFAs相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。