梁泳淋，巫園園，陳飛龍，蒙艷麗，王偉明，，湯慶發(fā)＊＊

（1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院/廣東省中藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省中藥制劑技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室 廣州 510515；2.黑龍江中醫(yī)藥科學(xué)院中藥所 哈爾濱 150036）

邪熱壅肺證是指邪熱內(nèi)壅于肺所表現(xiàn)的證候[1]，多因溫?zé)嶂坝煽诒嵌?，或風(fēng)寒、風(fēng)熱之邪入里化熱，內(nèi)壅于肺所致。肺失宣降、痰濁化生、肺絡(luò)損傷為本病病機(jī)。中醫(yī)所述邪熱包括了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中細(xì)菌、病毒、支原體等致病因素，所致臨床肺部癥狀以咳嗽、咯痰、發(fā)熱、氣粗而喘、胸痛為主。臨床上中醫(yī)多以麻杏石甘湯及其加減方劑[2]、白虎解毒湯[3]、桑杏清肺湯[4]以及定喘湯[5]等方劑治療邪熱壅肺證。

麻杏石甘湯出自《傷寒論》，臨床上主治邪熱壅肺證[6]。本方由麻黃、杏仁、石膏、炙甘草4味藥材組成，四藥合用，共成辛涼疏表，清肺平喘之功，可上宣肺熱，下通腸熱。多項(xiàng)臨床觀察表明，麻杏石甘湯加減對邪熱壅肺型的社區(qū)獲得性肺炎有明確的療效[7]。有研究顯示，麻杏石甘湯加減結(jié)合常規(guī)療法可治療邪熱壅肺證支氣管哮喘急性發(fā)作[8]。臨床實(shí)驗(yàn)顯示，麻杏石甘湯合千金葦莖湯加減聯(lián)合西藥治療慢阻肺急性加重期痰熱壅肺證患者療效顯著[9]。麻杏石甘湯治療新冠肺炎邪熱壅肺證起重要作用[10]。可見麻杏石甘湯對邪熱壅肺證具有明確作用。雖然對麻杏石甘湯研究較多，但麻杏石甘湯在治療邪熱壅肺證的作用機(jī)理至目前仍未明確。

中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為 “肺主宣發(fā)肅降” “大腸主傳化糟粕” ，肺的宣降與大腸的傳導(dǎo)變化聯(lián)系緊密。正因肺與大腸的密切關(guān)系，兩者會(huì)在病理方面互相影響。近年研究形成的 “肺腸軸” 理論：大腸中的腸道菌群對機(jī)體的免疫有調(diào)節(jié)作用，菌群的狀態(tài)對肺系疾病的轉(zhuǎn)歸有重要影響。現(xiàn)代 “肺腸軸” 被認(rèn)為是中醫(yī)基礎(chǔ)理論 “肺與大腸相表里”[11-12]理論延伸?；?“肺與大腸相表里” 結(jié)合 “肺腸軸” 理論，本實(shí)驗(yàn)以麻杏石甘湯為研究對象，采用肺炎鏈球菌建立邪熱壅肺證小鼠模型，利用高通量測序技術(shù)評價(jià)麻杏石甘湯對邪熱壅肺證小鼠的效果及其腸道菌群豐富度及多樣性變化，鑒定豐度顯著差異的菌屬，為闡明麻杏石甘湯治療邪熱壅肺證的作用機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

選取SPF級BALC/B小鼠24只，體質(zhì)量20-22 g，雌雄各半，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，許可證號(hào)SCXK（黑）2019-001，飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物房，溫度（22±2）℃，相對濕度60%±10%，12 h/12 h明暗周期，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

麻杏石甘湯（麻黃45 g，批號(hào)：1150101；苦杏仁45 g，批號(hào)：1150731；生石膏90 g，批號(hào)：8114489；炙甘草30 g，批號(hào)：8112328，均購于廣州致信中藥飲片有限公司）。將麻黃和生石膏加至2100 mL水中先煎30 min，加入苦杏仁、甘草熬至水沸后，小火煎煮15 min；濾出藥液后加1680 mL水進(jìn)行第2次煎煮（大火煮沸后，小火煎煮10 min），最后將2次藥液混合濃縮，制成10.02 g浸膏。樣品經(jīng)煎煮、過濾、濃縮后，置于4℃冰箱保存，備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組

小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成正常組（簡稱CON組，n=8，雌雄各半）、模型組（簡稱MOD組，n=8，雌雄各半）和麻杏石甘組（簡稱MXSG組，n=8，雌雄各半）。

2.2 動(dòng)物造模

邪熱壅肺證模型，需先犯手太陰經(jīng)，又肺主氣屬衛(wèi)，故始病于衛(wèi)，繼入氣分而歸于肺，取 “親” 上，邪入途徑為呼吸道，所以選用肺炎鏈球菌為造模因素，采用麻醉下鼻內(nèi)接種。接種后動(dòng)物繼現(xiàn)高熱、胃寒、喘促、氣急、鼻翼煽動(dòng)、躁動(dòng)不安、拒食、舌紅等，極似溫病學(xué)教材邪熱雍肺證的證候，出現(xiàn)上述癥狀即為造模成功。

模型的制備參考文獻(xiàn)中的[13]造模方法：將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2-3天，除正常對照組外，其余各組小鼠均在乙醚輕度麻醉下鼻內(nèi)接種（1×105CFU/mL）肺炎鏈球菌溶液，每只50μL，接種后呈45°保持30 s以利于溶液充分吸入，連續(xù)接種3天，建立小鼠邪熱壅肺證模型；正常組給予等量無菌生理鹽水滴鼻。

2.3 給藥

給予小鼠麻杏石甘湯劑量為15.12 g·kg-1，持續(xù)給藥14天。

2.4 樣本采集

各組小鼠，于給藥后的第14天采集糞便，采集后立刻放置-80℃保存。

2.5 DNA提取

主要試劑有TIANGEN糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，批號(hào)Q5306）；6×DNA loading buffer（天根生化科技有限公司，批號(hào)U8113）；Tris鹽酸緩沖液（北京酷來搏科技有限公司；批號(hào)SL30193303）；KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase（美國KAPA Biosystems，批號(hào)0000112224）；Midori Green Advance DNA Strain（德國Midori Green，批號(hào)310718）；AMPure XP（美國Beckman Coulter，批號(hào)17620100）。

所有樣本由深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行大鼠糞便總DNA提取建庫及質(zhì)檢，用KAPA HiFi擴(kuò)增16SV4區(qū)進(jìn)行16SrRNA基因測序檢測，抽取DNA后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA。按照實(shí)驗(yàn)操作說明對純化的DNA組進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。對樣品進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測、純化和定量，所有條帶均完整清晰、大小正確，滿足建庫需要，然后進(jìn)行文庫制備、文庫質(zhì)檢、定量，使用設(shè)定的TAG序列進(jìn)行樣本區(qū)分。

2.6 Illumina高通量測序

Illumina HiSeq2000高通量檢測基因序列，獲獨(dú)立細(xì)菌物種（OTU），分析腸菌多樣性，評價(jià)對小鼠腸菌結(jié)構(gòu)影響；PERMANOVA聚類富集核心OTU，分析與MXSG功效相關(guān)菌屬。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對小鼠腸道菌群Alpha多樣性、相對豐度結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SPSS20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3組小鼠模型評價(jià)

MOD組與MXSG組小鼠于造模當(dāng)天出現(xiàn)躁動(dòng)不安、盤旋等癥狀，造模第2天小鼠出現(xiàn)高熱、喘促、食欲減退癥狀，造模第3天出現(xiàn)鼻翼煽動(dòng)、呼吸困難的癥狀。兩組小鼠邪熱壅肺證模型建立成功。給藥后，MXSG組小鼠食欲較MOD組增加，鼻翼煽動(dòng)情況減輕，體溫恢復(fù)正常。CON組小鼠未出現(xiàn)高熱、喘促、食欲減退等癥狀。

3.2 藥物對小鼠菌群豐富度和多樣性的影響

3.2.1α多樣性分析

通過Alpha多樣性分析，反映三組小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性。本研究反映菌落豐富度使用了Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和sobs指數(shù)。與CON組對比，MOD組各樣本在Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和sobs指數(shù)升高，表明造模后，小鼠菌落豐富度增加。與MOD組相比，MXSG組各樣本指數(shù)升高，菌落豐富度優(yōu)于MOD組。菌落豐富度有顯著性差異（圖1）。

圖1 Alpha多樣性分析MXSG對腸道菌群結(jié)構(gòu)

3.2.2β多樣性分析

采用PCoA分析，對各組菌群結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行對比，確立小鼠腸道菌群是否發(fā)生整體結(jié)構(gòu)性變化。解釋PCoA圖，各樣本解釋度值PC1、PC2分別為26.56%、25.76%，CON組與MOD組樣本距離明顯，MXSG組樣本與MOD組距離明顯，說明與正常小鼠對比，邪熱壅肺證小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化且結(jié)構(gòu)差異明顯，麻杏石甘湯提高邪熱壅肺證小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性（圖2）。

圖2 PCoA分析MXSG對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

3.3 藥物對邪熱壅肺證小鼠腸道菌群相似度的影響

通過韋恩圖可以比較分析各組之間獨(dú)有和共有的OTU數(shù)目，進(jìn)而比較多個(gè)樣本群落間組成的相似度與重疊關(guān)系。3組共有的OTU數(shù)量為587，CON組、MOD組和MXSG組獨(dú)有的OTU數(shù)目分別為7、19和34，MOD組區(qū)別于CON組有58個(gè)OUTs，MOD組區(qū)別于MXSG組有40個(gè)OTUS。結(jié)果提示MXSG的使用可降低MOD組菌落相似度（圖3）。

圖3 韋恩圖分析MXSG對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

3.4 藥物對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的影響

從屬分類水平對MOD組與MXSG組腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的變化進(jìn)行分析。根據(jù)群落組成分析圖，可直觀呈現(xiàn)兩方面信息：一是上各樣本在某一分類學(xué)水平含有何種微生物；二是樣本中各微生物相對豐度（所占比重）。

在屬分類水平上，普雷菌屬（Prevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides）是各個(gè)時(shí)間段各組菌群中占比最高的菌屬，其次為顫螺旋菌屬（Oscillospira）和乳酸菌屬（Lactobacillus）。MOD組與CON組對比，梭菌屬、薩特氏菌屬、Odoribacter、副擬桿菌屬、乳酸菌屬含量有明顯的差異，一些有益菌落相對豐度降低（如擬桿菌屬、乳酸菌屬等）。給藥后，MXSG組與MOD組相比較，小鼠菌群中的副擬桿菌（Parabacteroides）、阿克曼氏菌（Akkermansia）、瘤胃球菌（Ruminococcus）豐度增加，乳酸菌屬和梭菌屬豐度降低，有顯著差異。結(jié)果表明邪熱壅肺證小鼠菌落結(jié)構(gòu)在給藥前后有顯著差異。麻杏石甘湯對邪熱壅肺證小鼠的部分有益菌如副擬桿菌、阿克曼氏菌、瘤胃球菌以及乳酸菌有顯著的調(diào)節(jié)作用（圖4、表1）。

表1 MXSG對小鼠腸道主要細(xì)菌屬水平含量的影響（xˉ±s）

圖4 各組對小鼠腸道主要細(xì)菌屬水平結(jié)構(gòu)的影響

3.5 LEfSe多級物種差異判別分析CON組、MOD組以及MXSG組小鼠腸道菌群的差異

LEfSe表示顯著性差異，可以檢測到豐度有顯著差異菌群。使用LEfSe對不同條件下菌群分類，通過對菌群數(shù)量、結(jié)構(gòu)變化，分析各樣品對邪熱壅肺證小鼠腸道菌群的作用。MXSG組在屬分類學(xué)水平上前10種細(xì)菌表現(xiàn)出顯著性差異為Verrucomicrobia，Verrucomicrobiales，Verrucomicrobiae，疣微菌（Verrucomicrobiaceae）、Allobaculum、變形菌門、阿克曼氏菌、彎曲菌屬（Campylobacterales）、Epsilonproteobacteia、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）。MOD組在屬分類學(xué)水平前 10種細(xì)菌為 Defluviitalea、變形 菌（Betaproteobacteria）、枯草桿菌（Bacillales）、嗜膽菌屬（Bilophila）、產(chǎn)堿菌科（Alcaligenaceae）、糞芽孢菌屬（Coprobacillus）、瘤胃球菌、梭菌屬（Clostridium）、Butyricimonas、Blautia。CON組在屬分類學(xué)水平上有5種細(xì)菌表現(xiàn)出顯著性差異，莫拉菌屬（Moraxellaceae）、帕拉普氏菌屬（Paraprevotella）、文肯菌屬（Rikenella）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、變形菌（Gammaproteobacteria）等在CON組中富集（圖5）。

圖5 各組差異菌屬分級圖

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以麻杏石甘湯為研究對象，采用肺炎鏈球菌建立邪熱壅肺證小鼠模型，利用高通量測序技術(shù)評價(jià)麻杏石甘湯對邪熱壅肺證小鼠的治療效果及其腸道菌群豐富度及多樣性變化，鑒定豐度顯著差異的菌屬。本研究證實(shí)，邪熱壅肺證小鼠增加了正常小鼠腸道菌群α多樣性；給予麻杏石甘湯后，麻杏石甘湯又進(jìn)一步顯著提高邪熱壅肺證小鼠腸道菌群α多樣性。β多樣性分析表明，正常組小鼠與邪熱壅肺證組小鼠的腸道菌群多樣性差異相對較大，麻杏石甘湯組與正常組小鼠腸道菌群多樣性差異相對較小。

LEfSe物種差異辨別分析表明，與正常組小鼠相比，模型組小鼠腸道菌群中瘤胃球菌、Sutterella、阿克曼氏菌、變形菌、枯草桿菌等菌屬相對豐度增加，而梭菌屬、乳酸菌屬豐度降低。給予麻杏石甘湯后，小鼠腸道菌群中副擬桿菌、阿克曼氏菌、瘤胃球菌相對豐度提高；疣微菌、副擬桿菌、瘤胃球菌等下調(diào)至正常水平。其中阿克曼氏菌主要代謝產(chǎn)物為丙酸，在腸道中可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，維持體內(nèi)代謝平衡[14-15]；乳酸菌可以通過影響短鏈脂肪酸的合成以輔助調(diào)節(jié)宿主代謝系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟，達(dá)到增強(qiáng)免疫力的作用[16]。瘤胃球菌、梭菌屬、Allobaculum[17]等均是產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs）的相關(guān)菌落，SCFAs作為抗原遞呈細(xì)胞的信號(hào)分子，誘導(dǎo)T細(xì)胞的分化，于肺部參與調(diào)節(jié)肺部炎癥及過敏反應(yīng)，免疫細(xì)胞通過識(shí)別SCFAs參與腸道的能量供應(yīng)來對宿主起重要的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[18-19]，改善肺部感染。由此可見，麻杏石甘湯給藥后，可能通過相關(guān)菌屬產(chǎn)生短鏈脂肪酸參與免疫調(diào)控抑制肺部炎癥，對邪熱壅肺證起治療作用。

本研究以麻杏石甘湯為研究對象，通過用高通量測序方式研究邪熱壅肺證小鼠腸道菌群豐富度及多樣性變化以及麻杏石甘湯對其腸道菌群的干預(yù)作用，鑒定25種豐度顯著差異的菌屬。我們的研究表明，邪熱壅肺證引起產(chǎn)生短鏈脂肪酸相關(guān)的腸道菌群結(jié)構(gòu)及其組成發(fā)生變化，麻杏石甘湯可能通過促進(jìn)邪熱壅肺證小鼠產(chǎn)生短鏈脂肪酸相關(guān)的菌屬豐度，參與免疫調(diào)控抑制肺部炎癥，從而發(fā)揮治療邪熱壅肺證作用。