田 濤，余敏靈

（1. 成都儲供基地成都藥材供應(yīng)站，四川 成都 610017； 2. 四川省樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

甘草為豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat. 或光果甘草 Glycyrrhizaglabra L. 的干燥根和根莖，收載于 2015 年版《中國藥典（一部）》，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳等功效［1－3］。采用以甘草酸銨、甘草苷為對照品的外標(biāo)法測定甘草酸和甘草苷含量［4］，存在對照品價格昂貴、易吸潮等缺陷［5］。替代對照品法是解決該問題的主要方法［6－13］。本研究中采用替代對照品內(nèi)加入法，以橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨色譜峰保留時間和紫外光譜特征相結(jié)合的定性方法，將對照品色譜峰提取的紫外光譜圖所建立的純度檢查圖庫應(yīng)用于色譜峰的定性中，通過甘草苷和甘草酸銨相對橙皮苷的相對校正因子（ f）計算甘草中甘草苷和甘草酸的含量，并對3 批樣品的測定結(jié)果與法定標(biāo)準(zhǔn)測定數(shù)據(jù)進(jìn)行比較?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配有二極管陣列檢測器和OpenLAB CDS 工作站；PE－A10 型高效液相色譜儀（珀金埃爾默公司），配有二極管陣列檢測器；Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾公司），配有二極管陣列檢測器；XSE205 Dual-Range 型電子天平（梅特勒－托利多公司，精度為0.01mg）；ULUP－Ⅱ－10T 型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）；CQ－100B 型超聲儀（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠，功率為200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

甘草苷對照品（批號為111610－201607，含量為93.1%），甘草酸銨對照品（批號為 110731 －201720，含量為97.7%），橙皮苷對照品（批號為110721－201818，含量為96.2%），均購于中國食品藥品檢定研究院；甘草酸單銨鹽A 原料藥（北京凱因科技股份有限公司，批號為1707003，含量為67.2%）；甘草（樂山市康發(fā)藥業(yè)有限公司，批號分別為 180913311，190613311，180721311）；乙腈為色譜純，磷酸、甲醇、三乙胺等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate LP－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－ 0.1% 三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH 至 2.5，B），梯度洗脫 （程序見表 1）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：276 nm（甘草苷），284 nm（橙皮苷），252 nm（甘草酸銨）；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取甘草苷對照品17.84 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為甘草苷對照品貯備液；取橙皮苷對照品 64.12 mg，精密稱定，置250 mL 容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為橙皮苷對照品貯備液；取甘草酸銨對照品11.08 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為甘草酸銨對照品貯備液。分別精密量取甘草苷對照品貯備液2.5 mL，橙皮苷對照品貯備液2 mL，甘草酸銨對照品貯備液1 mL，置同一10 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取甘草（批號為180913311）粉碎，過3號篩，取細(xì)粉 0.2 g，精密稱定，置 50 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液適量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

橙皮苷－樣品混合液：另取上述細(xì)粉0.2 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液適量，超聲處理（功率為250 W，頻率為 40 kHz）30 min，放冷，精密加入橙皮苷對照品貯備液10 mL，用80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

空白溶劑：80%甲醇溶液。

2.3 測定波長選擇

在混合對照品溶液提取的甘草苷、橙皮苷、甘草酸銨紫外光譜圖中，甘草苷、橙皮苷、甘草酸銨分別在276，284，252 nm 波長處有最大吸收，光譜圖見圖 1。故選擇測定波長為276 nm（甘草苷）、284 nm（橙皮苷）、252 nm（甘草酸銨）。

圖1 紫外光譜圖A.Mixed reference solution B.Hesperidin－sample mixed solutionFig.1 Ultraviolet spectrogram

2.4 f 耐受性考察

取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，考察耐受性［14－15］。分別在使用 3 臺不同型號液相色譜儀（Aglient 1260 型、PE －A10 型、Ultimate 3000 型 ），測 定 波 長 （248 ／272 ／280，250 ／274 ／282，252 ／276 ／284，254 ／278 ／286，256 ／280 ／288 nm），柱溫（28.0，29.0，30.0，31.0，32.0℃），流動相 pH 值（2.3，2.5，2.7，2.9），流速（0.900，0.950，1.000，1.050，1.100mL／min）條件下測定，計算 f。結(jié)果見表2。

表2 相對校正因子耐受性考察結(jié)果Tab.2 Results of tolerance test of relative correction factors

2.5 f 測定

分別取 2.2 項下混合對照品溶液 2，5，10，15，20，25μL，按2.1 項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸（校正截距為 0）?；貧w方程分別為 Y甘草苷＝1 929.190 8 X甘草苷（r ＝0.999 5）、Y橙皮苷＝1 783.181 4 X橙皮苷（r ＝0.999 4）、Y甘草酸銨＝802.771 3 X甘草酸銨（r ＝0.999 7）。結(jié)果表明，甘草苷、橙皮苷和甘草酸銨進(jìn)樣量分別在0.083 0 ～1.038 1 μg、0.098 7 ～ 1.233 7 μg、0.216 5 ～ 2.706 3 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以甘草苷和甘草酸銨回歸曲線斜率與橙皮苷回歸曲線斜率的比值分別計算 f，以2.4 項下3 臺液相色譜儀所測平均值為最終 f，結(jié)果甘草苷、甘草酸銨與橙皮苷在不同考察條件下測得的 f的平均值分別為 1.081 3 和 0.449 5，RSD 分別為0.27%和 0.23%（n ＝3）。

2.6 紫外光譜穩(wěn)定性和相對保留時間考察

取2.2 項下混合對照品溶液和橙皮苷－樣品混合溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，除測定波長外，按2.4項下條件測定，記錄色譜圖。比較混合對照品溶液和橙皮苷－樣品混合溶液各組分在不同條件下色譜峰相對保留時間的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、提取紫外光譜圖中吸收曲線的最大吸收波長及各組分對照品建立的紫外圖庫比較的匹配因子平均值，結(jié)果見表3?？梢?，不同測定條件下相對保留時間變化的 RSD 均未超過規(guī)定值2.0%，在各測定條件下，甘草苷（276 nm）／橙皮苷（284 nm）／甘草酸銨（252 nm）最大吸收波長均無變化（≤±2 nm），匹配因子均大于 999.96 ／1 000。

表3 紫外光譜穩(wěn)定性和相對保留時間耐受性考察結(jié)果Tab.3 Results of UV spectrum stability test and relative retention time tolerance test

2.7 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液、橙皮苷－樣品混合溶液、空白溶劑，按2.1 項下色譜條件測定，色譜圖見圖2。結(jié)果橙皮苷－樣品混合溶液色譜圖中，有與混合對照品溶液色譜圖中甘草苷、橙皮苷和甘草酸銨相應(yīng)的色譜峰，各組分色譜峰與其相鄰的色譜峰分離度均大于1.5；供試品溶液色譜圖中，有與混合對照品溶液色譜圖中甘草苷和甘草酸銨相應(yīng)的色譜峰，且樣品溶液色譜圖中，在與橙皮苷－樣品混合溶液色譜圖橙皮苷色譜峰相應(yīng)位置上無色譜峰。以混合對照品溶液色譜圖中橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨的色譜峰提取紫外圖譜建立其相應(yīng)的純度檢查圖庫，并與橙皮苷－樣品混合溶液色譜圖中各成分色譜峰紫外圖譜比較，橙皮苷色譜峰匹配因子為999.954／1 000，甘草苷色譜峰匹配因子為999.917／1 000，甘草酸銨匹配因子為999.936／1 000。橙皮苷色譜峰與甘草苷和甘草酸銨色譜峰保留時間的比值分別為1.335 0 和0.541 0。由圖2 C 可知，混合對照品溶液色譜圖中，甘草苷、橙皮苷、甘草酸銨出峰時間分別為13.213，17.639，32.602min；混合對照品溶液和橙皮苷－樣品混合溶液色譜圖中，橙皮苷、甘草苷、甘草酸銨色譜峰紫外光譜圖分別于284，276，252 nm 波長處有最大吸收。

圖2 高效液相色譜圖1. liquirtin 2.hesperidin 3.ammonium glycyrrhizinatea.Blank solution b.Sample solution c.Mixed reference solution d. Hesperidin － sample mixed solutionA.276 nm B.252 nm C.284 nmFig.2 HPLC chromatograms

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果甘草苷、橙皮苷、甘草酸銨的 RSD 分別為 0.22% ，0.18% ，0.23%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取 2.2 項下甘草細(xì)粉 0.2 g，精密稱定，共6 份，依法制備橙皮苷－樣品混合溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果橙皮苷平均峰面積為881.4，甘草苷和甘草酸銨的平均峰面積（以稱樣量為 0.2 g 計算）分別為 562.4 和 817.5，RSD 分別為 0.65%和 0.72%（n ＝6），表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下橙皮苷－樣品混合溶液，分別于室溫放置 0，2，4，6，8，12，24 h 時，按 2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果甘草苷、橙皮苷和甘草酸銨色譜峰峰面積變化不大，RSD 分別為 0.28% ，0.37% ，0.31%（n ＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

檢測限與定量限確定：取2.2 項下混合對照品溶液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果甘草苷（276 nm）、甘草酸銨（252 nm）的信噪比（S ／ N）分別為 30.4 和 77.6。分別以 S ／ N 的3 倍和10 倍計算檢測限和定量限，結(jié)果甘草苷（276 nm）的檢測限與定量限（以進(jìn)樣量計）分別為1.64 ng 和5.46 ng，甘草酸銨（252 nm）的檢測限與定量限（以進(jìn)樣量計）分別為 1.67 ng 和 5.58 ng。

加樣回收試驗：取甘草酸單銨鹽A 原料藥334.82mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為甘草酸銨原料藥貯備液；取2.2 項下甘草細(xì)粉（每 1 g 樣品中含甘草苷 7.296 1 mg，甘草酸 24.914 1 mg）0.1 g，精密稱定，置 50 mL 容量瓶中，精密加入甘草苷對照品貯備液4 mL，甘草酸銨原料藥貯備液1 mL，橙皮苷對照品貯備液10 mL，按2.2 項下方法制備橙皮苷－樣品混合溶液，平行6 份，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。按 Cm＝（Am×Cs）／（f× AS）計算含量。式中，Cm為供試品溶液中甘草苷或甘草酸銨的進(jìn)樣量（μg），Am為供試品溶液中甘草苷或甘草酸銨的峰面積，Cs與 AS分別為供試品溶液中橙皮苷的進(jìn)樣量（μg）與峰面積。甘草酸含量＝測得的甘草酸銨含量×0.979 7。結(jié)果見表4。

表4 替代對照品法加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.4 Results of the recovery test by the replacement method of chemical reference substance（n ＝6）

2.8 樣品含量測定

取甘草，粉碎，過3 號篩，取細(xì)粉0.2 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，依法制備橙皮苷－樣品混合溶液和供試品溶液，取橙皮苷－樣品混合溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。按加樣回收試驗項下方法計算被測定樣品中甘草苷和甘草酸銨進(jìn)樣量，以進(jìn)樣量計算每1 g 樣品中甘草苷和甘草酸含量，并將測定結(jié)果與法定檢驗方法測定結(jié)果比較。結(jié)果見表5。

表5 3 批樣品含量測定結(jié)果Tab.5 Content determination of liquirtin and glycyrrhizic acid in three batches of samples

3 討論

替代對照品內(nèi)加入法是將替代對照品定量加入被測定溶液中作為供試品溶液，并按規(guī)定色譜條件進(jìn)樣分析，以色譜圖中替代對照品峰面積和被測定成分峰面積，通過替代對照品與被測定成分的 f 計算被測定成分含量的方法。使用替代對照品內(nèi)加入法測定樣品，應(yīng)對未加入替代對照品的樣品溶液進(jìn)行分析，在替代對照品所選定的檢測波長的色譜圖中，與替代對照品保留時間一致的位置上不應(yīng)有其他干擾峰。

本試驗中，色譜柱的改變對相對保留時間有較大影響，建議實驗室采用Welch Ultimate LP－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；定性色譜峰時，參照國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH06492018 有關(guān)物質(zhì)項下相對保留時間確定方法，建議相對保留時間的數(shù)值保留一位有效數(shù)字，通過與對照品色譜峰所建立的紫外純度檢測圖庫比較，并按匹配因子和紫外特征吸收進(jìn)行定性，由于在OpenLAB CDS 工作站建立的圖庫文件只能應(yīng)用于其他Agilent 高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器和系列OpenLAB CDS 工作站（安捷倫公司），故采用該法作為色譜峰定性使用有較大局限性，在其他操作系統(tǒng)應(yīng)用時還需建立其他操作系統(tǒng)的相關(guān)圖庫。

替代對照品內(nèi)加入法中，不再單獨制備和測定對照品溶液，簡化了操作過程。該方法同時測定對照品和樣品，與外標(biāo)法相比，結(jié)果更準(zhǔn)確，測定時間更短，相對保留時間更穩(wěn)定。但由于替代對照品是加入供試品溶液，試驗時要確認(rèn)樣品溶液色譜圖在替代對照品色譜峰的位置是否有其他物質(zhì)色譜峰的干擾，以排除干擾，可采用供試品溶液色譜圖和樣品加替代對照品溶液色譜圖比較或色譜峰純度檢查。