孫麗君 ，王玉華 ，李瑞娟 ，王秋桐

（1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110； 2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110）

山苦荬 Ixeris chinensis （Thunb. ） Nakai 為菊科 Compositae 苦荬菜屬 Ixeris 植物，蒙藥材名為蘇素－烏布斯，在內(nèi)蒙古自治區(qū)分布廣泛，收載于《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》［1］，具有抑協(xié)日、清熱作用，蒙醫(yī)臨床多用于治療肝膽熱、肝炎等疾?。?－4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山苦荬具有抗腫瘤活性、鎮(zhèn)痛、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用［5－6］。其所含成分復(fù)雜，主要包括黃酮類、倍半萜內(nèi)酯類、三萜皂苷類等化合物［6－7］。本研究中檢測(cè)了12 批山苦荬藥材的指紋圖譜，并采用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析法分析隱藏信息，尋找并區(qū)分不同品質(zhì)山苦荬的標(biāo)志性成分，為該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Fisher UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；AL204 型分析天平（美國Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；KQ－250DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為 350 W，頻率為 36 ～ 44 kHz）。

1.2 試藥

木犀草苷（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111720 －200905）；乙腈、甲醇（Fisher 公司）為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水；12 批不同產(chǎn)地的山苦荬采自山西、內(nèi)蒙古自治區(qū)不同盟市，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院龐秀生教授鑒定為菊科苦荬菜屬植物山苦荬 Ixeris chinensis （Thunb. ） Nakai。藥材均密封保存于陰涼干燥處，藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備［8 －9］

取木犀草苷適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.102 mg 的溶液，即得對(duì)照品溶液。取山苦荬藥材粉末（過4 號(hào)篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，加入0.5 mL 磷酸，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 山苦荬指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Apollo C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.04%磷酸溶液（A）－乙腈（B），梯度洗脫（0 ～5 min時(shí) 100%A→90%A，5 ～ 8 min 時(shí) 90%A→85%A，8 ～28 min 時(shí) 85%A→75%A，28 ～41 min 時(shí) 75%A→70%A，41 ～ 43 min 時(shí) 70%A→69%A，43 ～60 min 時(shí) 69%A→50%A）；流速：0.8 mL ／ min；柱溫：30 ℃ ；檢測(cè)波長：220 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)［10－13］

取12 批山苦荬藥材，按2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）軟件分析12 批山苦荬藥材的色譜數(shù)據(jù)，以S12 號(hào)樣品的色譜圖作為參照譜圖，時(shí)間窗寬度為0.10，采用多點(diǎn)校正的方式，得到12 批山苦荬藥材的疊加圖譜（見圖1）；以12 批藥材的共有模式為對(duì)照色譜圖，共標(biāo)定17 個(gè)共有峰（見圖2）；通過對(duì)照，指認(rèn)出10 號(hào)峰為木犀草苷峰，峰面積適中，且不同批次樣品中穩(wěn)定存在，故選其作為參比峰（見圖3）。將12 批山苦荬藥材與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度比較，結(jié)果 17 個(gè)共有峰的相似度介于 0.914 ～0.992（r ＝1.000），表明不同批次山苦荬藥材的化學(xué)成分均較穩(wěn)定。

圖1 12 批山苦荬藥材的高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 12 batches of Ixeris chinensis

圖2 山苦荬藥材的共有模式圖譜Fig.2 Common pattern of Ixeris chinensis

圖3 山苦荬藥材與木犀草苷對(duì)照品的對(duì)比色譜圖Fig.3 Contrast chromatogram of Ixeris chinensis and luteoloside

2.2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取S12 號(hào)山苦荬藥材適量，精密稱定，按 2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。結(jié)果以10 號(hào)峰為參比峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的 RSD 均小于2.00%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S12 號(hào)山苦荬藥材適量，精密稱定，按 2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2.2.1 項(xiàng)下色譜條件，分別于 0，3.5，7.0，10.5，14.0 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果以10 號(hào)峰為參比峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的 RSD 均小于 3.00%（n ＝ 5），表明供試品溶液在14 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S12 號(hào)山苦荬藥材適量，精密稱定，按2.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，分別按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果以10 號(hào)峰為參比峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的 RSD均小于 3.00%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析［14 －15］

聚類分析：將12 批山苦荬藥材共有峰峰面積的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，使用沃德聯(lián)接譜系圖重新標(biāo)度的距離聚類組合，采用平方歐氏距離對(duì)藥材進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（見圖4）。結(jié)果顯示，12 批山苦荬藥材大致分為 4 類，Ⅰ類包括 S1，S2，S7，S8，S9，S10，S12；Ⅱ類包括 S3，S6；Ⅲ類包括 S5，S11；Ⅳ類包括 S4。結(jié)合表1 可知，S4 和S5 均采自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市，但S4 單獨(dú)聚為了一類?？梢姡幢闶峭划a(chǎn)地，也有個(gè)別批次的藥材質(zhì)量存在較大差異。

圖4 12 批山苦荬藥材的聚類分析結(jié)果Fig.4 Dendrogram of cluster analysis of 12 batches of Ixeris chinensis

主成分分析：以12 批山苦荬藥材中17 個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA－P 軟件進(jìn)行主成分分析，以主成分的特征根和貢獻(xiàn)率作為選擇主成分的依據(jù)，模型自動(dòng)擬合選擇 4 個(gè)主成分，其特征根分別為6.79，2.21，1.20，1.02，方 差 貢 獻(xiàn) 率 分 別 為 56.60% ，18.40% ，10.00% ，8.52% ，累 積 方 差 貢 獻(xiàn) 率 大 于93.50%，提示模型預(yù)測(cè)良好。詳見圖5?？梢?，12 批山苦荬藥材被分為4 類，與聚類分析結(jié)果一致。

圖5 12 批山苦荬藥材的主成分分析得分圖Fig.5 PCA score chart of 12 batches of Ixeris chinensis

偏最小二乘回歸分析（PLS－DA）：采用SIMCA－P軟件建立PLS－DA 模型，采用監(jiān)督模式識(shí)別法進(jìn)行兩組間的PLS－DA。結(jié)果見圖6 和圖7。PLS－DA 模型得分圖顯示，樣品可很好地區(qū)分為4 類，與聚類分析、主成分分析結(jié)果一致。以模型變量投影（VIP）值為指標(biāo)，對(duì)引起組間差異的成分進(jìn)行分析，VIP 圖可反映出每個(gè)峰的貢獻(xiàn)程度。以 VIP ＞1 為原則，得出 1，2，5，7，8，10，11，13，15 號(hào)峰可能是區(qū)分樣品最關(guān)鍵的色譜峰，對(duì)樣品分類作用較大。

圖6 12 批山苦荬藥材的PLS－DA 模型得分圖Fig.6 PLS －DA score chart of 12 batches of Ixeris chinensis

圖7 12 批山苦荬藥材的PLS－DA 結(jié)果Fig.7 PLS －DA results of 12 batches of Ixeris chinensis

3 討論

3.1 提取方法考察

本試驗(yàn)中分別對(duì)提取溶劑（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇）、提取方式（超聲提取和加熱回流提?。约疤崛r(shí)間（30，40，50 min）進(jìn)行了考察，以色譜峰信息的最大化、提取效率高為指標(biāo)，最終確定山苦荬的最佳提取方式為以60%甲醇為提取溶劑，超聲提取40min。

3.2 色譜條件考察［16］

本試驗(yàn)中分別對(duì)色譜條件中的流動(dòng)相體系（乙腈－0.04%磷酸溶液、甲醇－水、甲醇－0.02%磷酸溶液、甲醇－0.04%磷酸溶液、甲醇－0.06%磷酸溶液、甲醇－0.08%磷酸溶液、甲醇－0.1%磷酸溶液）、檢測(cè)波長（全波長掃描），以及柱溫（20，25，30，35 ℃ ）和流速（1.0，0.8 mL／min）進(jìn)行了考察，以色譜峰數(shù)、峰面積和分離效果為指標(biāo)，最終確定了2.2.1 項(xiàng)下的色譜條件。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了山苦荬藥材的高效液相色譜指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該藥材中 1，2，5，7，8，10，11，13，15 號(hào)色譜峰對(duì)應(yīng)的 9 個(gè)成分受生長環(huán)境的影響較大，可能為山苦荬中起決定性作用的化學(xué)成分，可全面反映內(nèi)蒙古自治區(qū)范圍內(nèi)不同盟市山苦荬藥材的質(zhì)量差異，進(jìn)而為完善山苦荬的地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。