肖 璜，戴 翚，周發(fā)友，馬仕洪

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

藥品微生物限度檢查于1972 年在國內(nèi)起步，衛(wèi)生部1978 年頒布了首個藥品微生物限度標準，1995 年版《中國藥典》首次收載了微生物限度檢查法，2000 年版《中國藥典》首次收載了微生物限度標準，2005 年版《中國藥典》強調(diào)了藥品微生物檢驗中的“方法驗證”，以避免因方法不合理而造成漏判、誤判。2015 年版《中國藥典》解決了與人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議（ICH）協(xié)調(diào)案的協(xié)調(diào)問題，實現(xiàn)了與國際標準的全面接軌，強化了操作關(guān)鍵點的控制［1］。我國藥品微生物限度檢查起步較早，標準已對標國際，但因?qū)嶒炇覘l件、人員技術(shù)水平、對標準和方法的理解存在差異，故各實驗室微生物限度檢測能力不同［2－5］。文獻［6］報道，地方藥品檢驗系統(tǒng)食品菌落總數(shù)計數(shù)能力驗證能力需加強。需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）［7］，是藥品微生物限度檢查的重要項目，用以判斷樣品被微生物污染的程度，反映藥品生產(chǎn)、運輸、儲存等環(huán)節(jié)質(zhì)量的優(yōu)劣。能力驗證是利用實驗室間的比對，按預(yù)先制訂的準則評價參與者的能力［8－9］。實驗室比對是指按預(yù)先規(guī)定的條件，由 2 個或多個實驗室對相同或類似的測試樣品進行檢測的組織、實施和評價［8］，是國際通行的實驗室質(zhì)量控制和認可機構(gòu)確認實驗室能力的有效技術(shù)手段。2015 年版《中國藥典》［7］也明確，在外部質(zhì)量控制評估中，實驗室應(yīng)參與能力驗證來評估檢測能力的水平，通過參加外部質(zhì)量評估來評定檢測結(jié)果的偏差。實驗室對評估結(jié)果進行分析后可適時改進。質(zhì)控樣品的均勻性和穩(wěn)定性是能力驗證項目實施的關(guān)鍵［6，10－14］。本研究中通過考察板藍根顆粒菌落總數(shù)樣品（小樣和正式樣品）的均勻性，以及儲藏、運輸?shù)姆€(wěn)定性來確保其滿足能力驗證要求?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與菌株

儀器：SJ－CJ－2FD 型超凈工作臺，BHC1300ⅡA2型生物安全柜，均購于阿爾泰實驗室設(shè)備＜北京＞有限公司；BCD－118TMPA 型海爾電冰箱（海爾智家股份有限公司）；LT－CPS80C 型立式壓力蒸汽滅菌鍋（立德泰克力＜上海＞科學儀器有限公司）；DZX－50KB 型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；ZXDP－A2270型恒溫培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；DN－300M 型生物顯微鏡（寧波永新光學股份有限公司）；ZYO－0.5 型藥用真空冷凍干燥機（上海東富龍科技股份有限公司）。

試劑：冷凍保護液（溫州微穹微生物技術(shù)有限公司）；TSA 培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技公司）。

菌株：萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus，ATCC 9372，美國醫(yī)學菌株保藏管理中心）；短小芽孢桿菌［ Bacillus pumilus，CMCC（B）63202，中國醫(yī)學細菌保藏管理中心］。

1.2 樣品制備及考察

1.2.1方案設(shè)計

樣品為鋁塑袋包裝的板藍根顆粒，設(shè)置陽性和陰性兩組樣品。陰性樣品用于方法驗證，計數(shù)結(jié)果無需上報；陽性樣品用于開展試驗，計數(shù)結(jié)果上報。試驗參照《NIFDC－PT－196 板藍根顆粒需氧菌總數(shù)能力驗證作業(yè)指導書》（以下簡稱《作業(yè)指導書》）進行。

1.2.2 樣品制備

陰性樣品：板藍根顆粒在裝袋前滅菌，直接用鋁箔袋包裝，每袋10 g。

陽性樣品：將菌株培養(yǎng)成孢子并收集，制成孢子懸液，通過純化使其最終的孢子形成率大于95%；孢子懸液再通過80 ～85 ℃高溫處理15 min，得到穩(wěn)定可靠的孢子，計數(shù)制得的孢子懸液；混懸均勻的孢子懸液，按目標菌數(shù)加入板藍根顆粒樣品中；板藍根顆粒在混入凍干菌株前應(yīng)滅菌，確保板藍根初始污染水平一致。

1.2.3 樣品考察

因為定量樣品的均勻性和穩(wěn)定性對于后期試驗結(jié)果回收影響大，故制備了2 批樣品。小樣制備量為100 個，正式樣品制備量為600 個。按照《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》（CNAS － GL03）［10］，采用單因素分析法檢驗樣品的均勻性，當 F 值 ＜ F 臨界值（ F0.05）時，認為樣品制備充分均勻。采用 t 檢驗法進行穩(wěn)定性考察，當 ｜tstat｜值 ＜ t 單尾臨界值（ t0.05）時，表明考察期內(nèi)樣品穩(wěn)定。

均勻性：1）小樣，在制作過程的前、中、后取10 個樣品檢查制作的均勻性。2）正式樣品，在制作過程的前、中、后取40 個樣品檢測制作的均勻性。

穩(wěn)定性：1）小樣。取24 個樣品監(jiān)控37 ℃高溫模擬運輸72 h 的穩(wěn)定性，檢查其中6 個樣品；取18 個樣品監(jiān)控室溫90 d 保存的穩(wěn)定性，檢查其中6 個樣品；取18個樣品監(jiān)控4 ℃、90 d 保存的穩(wěn)定性，檢查其中6 個樣品。2）正式樣品。結(jié)合小樣的穩(wěn)定性監(jiān)控結(jié)果、發(fā)樣時間（2019 年 9 月 24 日至 9 月 26 日）和據(jù)報名預(yù)測運輸時間（偏遠地區(qū)6 d），增加37 ℃高溫模擬運輸144 h 和45 ℃高溫模擬運輸97 h 的穩(wěn)定性監(jiān)控，各檢查6 個樣品。

1.3 計劃實施

1.3.1 參加機構(gòu)

全國共152 個實驗室，涉及31 個?。ㄊ校?、自治區(qū)，地域和單位屬性分布見表1。本次能力驗證主要以食藥監(jiān)系統(tǒng)實驗室為主。

表1 參加機構(gòu)地域和單位屬性分布（個）Tab.1 Geographical and unit attribute distribution of participating institutions（unit）

1.3.2 隨機編號

由中國藥檢能力驗證服務(wù)平臺（以下簡稱平臺）對參與實驗室樣品進行隨機編號。

1.3.3 運輸包裝

選擇聚乙烯自封袋包裝產(chǎn)品，雙人雙核，再用防撞袋包裝，放入隔熱聚乙烯泡沫箱，每個箱內(nèi)放置4 個冰袋，打包后當天運輸。

1.3.4 檢測方法

《作業(yè)指導書》中明確規(guī)定樣品保存于2 ～8 ℃，供試品制備需將鋁塑袋打開，整體轉(zhuǎn)移至90 mL 滅菌氯化鈉蛋白胨溶液，作為1 ∶10 供試品溶液，保證樣品分散均勻。規(guī)定按照2015 年版《中國藥典（四部）》通則中“1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”項下平皿法（傾注法），平行測定兩皿。結(jié)果須通過平臺上報，報告測定平行計數(shù)結(jié)果和樣品中需氧菌總數(shù)（cfu／g）。

1.3.5 結(jié)果評價原則

根據(jù)回收的實驗室結(jié)果，將報告值顯著低于預(yù)期的判定為離群值，予以剔除。以其他數(shù)據(jù)的對數(shù)中位值作為指定值，以對數(shù)中位值 ± 0.5 作為能力評定標準［15］。

本次樣品考核的結(jié)論設(shè)為滿意、不滿意。滿意：在規(guī)定截止日期上報結(jié)果，對數(shù)中位數(shù)－0.5≤報告值的對數(shù)值≤對數(shù)中位數(shù)＋0.5。不滿意：1）在規(guī)定截止日期未上報結(jié)果，且未主動與實施方進行溝通；2）因樣品損毀，上報結(jié)果為未開展實驗；3）在規(guī)定截止日期上報結(jié)果，報告值為異常值（為零，或數(shù)量級存在差異）；4）在規(guī)定截止日期內(nèi)上報結(jié)果，報告值的對數(shù)值＞對數(shù)中位數(shù)＋0.5或報告值的對數(shù)值＜對數(shù)中位數(shù)－0.5。符合上述4 項中其中1 項即可判定為不滿意。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻性結(jié)果

結(jié)果見表 2 和表 3。小樣 F0.05＝ 3.02，計算 F ＝0.64 ＜ F0.05，表明差異無統(tǒng)計學意義，小樣的菌落數(shù)組間均勻；正式樣品 F0.05＝ 1.70，計算的 F ＝ 1.06 ＜ F0.05，表明差異無統(tǒng)計學意義，正式樣品的菌落數(shù)組間均勻。由兩輪次樣品的均勻性試驗結(jié)果可見，制備工藝可靠，樣品均勻性符合要求。

表2 小樣單因子方差分析結(jié)果Tab.2 Results of one－way ANOVA of small sample

表3 正式樣品單因子方差分析結(jié)果Tab.3 Results of one－way ANOVA of formal samples

2.2 穩(wěn)定性結(jié)果

結(jié)果見表 4 和表 5。小樣 t0.05＝2.02，計算 t4℃，90d＝1.99，t室溫，90 d＝ 0.75，t37℃，72h＝ 1.16，均小于 t0.05，和第 0 天相比，3 個平均值間的差異均無統(tǒng)計學意義。小樣的穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，在4 ℃和室溫條件保存90 d，樣品穩(wěn)定性符合要求，運輸穩(wěn)定性通過37 ℃、72 h 的極端挑戰(zhàn)，符合要求。正式樣品 t0.05＝2.02，計算 t37℃，144h＝ 0.47，t45℃，97h＝ 0.42，均小于 t0.05，和第 0 天相比，2 個平均值間的差異均無統(tǒng)計學意義。正式樣品的穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，運輸穩(wěn)定性通過 37 ℃ 、144 h 和 45 ℃ 、97 h 的極端模擬挑戰(zhàn)，也符合要求，可保證偏遠地區(qū)樣品運輸?shù)姆€(wěn)定性。

表4 小樣 t 檢驗結(jié)果Tab.4 t－ test results of small samples

表5 正式樣品 t 檢驗結(jié)果Tab.5 t－test results of formal samples

2.3 能力驗證統(tǒng)計結(jié)果

本次能力驗證共152 個實驗室報名參加，食藥監(jiān)系統(tǒng)有1 個實驗室中途退出，3 個實驗室在規(guī)定時限內(nèi)未提交檢測結(jié)果，最終148 個實驗室在規(guī)定時限內(nèi)提交了檢測結(jié)果。計算剔除離群值的數(shù)據(jù)對數(shù)中位值為2.79，按照結(jié)果評價的原則，結(jié)果對數(shù)值滿意范圍為2.29 ～3.29；報告值滿意范圍為195 ～1 950 cfu／g。按結(jié)果評價的原則，未提交檢測結(jié)果的3 家機構(gòu)的實驗室直接判定為不滿意。上報的148 個實驗室檢測結(jié)果中，141 個為滿意，7 個為不滿意，整體滿意率為 93.38% （141 ／ 151）。結(jié)果按單位屬性統(tǒng)計，食藥監(jiān)系統(tǒng)滿意率為96.88%（91 ／94），企業(yè)滿意率為 87.04% （47 ／54），科研院所滿意 率 為 100.00% （1 ／1），檢 驗 檢 測 機 構(gòu) 滿 意 率 為100.00% （2 ／2）。

2.4 不滿意結(jié)果原因分析

本次能力驗證共152 個實驗室報名參加，1 個實驗室中途退出，3 個實驗室在規(guī)定時限內(nèi)未提交檢測結(jié)果，原因為：實驗室檢驗檢測能力正在建設(shè)調(diào)整；收樣后未開展工作；自身原因。

上報的148 個實驗室檢測結(jié)果中，7 個結(jié)果不滿意，結(jié)合平臺提交結(jié)果和原始記錄分析，原因為：操作人員原始記錄正確，平臺上報結(jié)果產(chǎn)生錯誤（5 個）；實驗人員培訓不足致試驗中斷（1 個）；檢測結(jié)果溢出（1 個）。

3 討論

通過考察樣品的均勻性和穩(wěn)定性可見，本次能力驗證的樣品均勻、穩(wěn)定；通過回收數(shù)據(jù)可見，未發(fā)現(xiàn)質(zhì)量問題和破損問題，表明樣品穩(wěn)定性好。本次能力驗證中，樣品均勻性和穩(wěn)定性考察、統(tǒng)計設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果評價等環(huán)節(jié)均符合《能力驗證提供者認可準則在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS － CL03 － A001，以下簡稱《說明》）［15］。該《說明》中，微生物水平較高的定量計劃，可將參加者結(jié)果轉(zhuǎn)換為以10 為底的對數(shù)值，通過計算統(tǒng)計量［ Z 值、臨界值（CD 值）、中位值 ± 0.5］來評定參加者的能力。本次能力驗證活動中選擇了以對數(shù)中位值±0.5 進行評定。同時，此評價標準也符合2015 年版《中國藥典》要求，即微生物計數(shù)同一供試品重復性允許誤差為2 次測定結(jié)果對數(shù)值之差不超過0.3，重復性允許誤差為2 次測定結(jié)果對數(shù)值之差不超過 0.5［16］。

實驗室質(zhì)量管理工作分為人員、培養(yǎng)基、試劑、菌種、環(huán)境、設(shè)備、樣品、檢測方法、污染廢棄物處理、檢測結(jié)果質(zhì)量保證和檢測過程質(zhì)量控制、實驗記錄、結(jié)果判斷和檢測報告、文件共13 個要素，2015 年版《中國藥典（四部）》9203 章節(jié)《藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則》中有詳細描述［2］。通過本次能力驗證，全面考察了其中11 個要素（除菌種和污染廢棄物處理）?；厥盏?48個實驗室檢測結(jié)果中，實際僅有1 個數(shù)據(jù)溢出，說明參與單位藥品需氧菌總數(shù)測試能力整體達到優(yōu)秀水平?？梢姡藛T是影響微生物檢驗檢測結(jié)果的重要因素，回收的148 個實驗室的檢測結(jié)果中，6 個不滿意結(jié)果均為人員操作失誤導致，且上述提到的1 個數(shù)據(jù)溢出可能也與操作人員能力和經(jīng)驗不足有關(guān)。說明需要不斷提高人員的操作能力，加強相關(guān)培訓，不斷提高檢驗檢測標準和能力建設(shè)要求。

需要指出的是，以上結(jié)果均在對數(shù)中位值±0.5 的統(tǒng)計值評定下得到。本次能力驗證為藥品微生物檢驗檢測領(lǐng)域內(nèi)首次開展全國范圍內(nèi)的定量能力驗證，在組織和統(tǒng)計上存在缺乏經(jīng)驗指引的不足，統(tǒng)計指標選擇較初級。如果選用微生物國際能力驗證中最常采用的 Z 值，以對數(shù)中位值為指定值（X），以標準化四分位距為能力評定標準差（σ）作為統(tǒng)計值。即｜Z ｜≤2.0 為滿意，2.0 ＜｜Z ｜＜ 3.0 為有問題，｜Z ｜≥3.0 為不滿意，以此評定準則來進行評定。整體滿意率為 93.38%（141／151），如按上述標準，142 個實驗結(jié)果（148 個返回結(jié)果，去除人員操作失誤的6 個結(jié)果）中，有7 家機構(gòu)的試驗結(jié)果不滿意，有6 家機構(gòu)的試驗結(jié)果可疑。最終結(jié)果滿意率下降為85.43%（129／151），從側(cè)面反映本次能力驗證方案中統(tǒng)計設(shè)計相對簡單。

本次能力驗證方案設(shè)計中還存在其他不足和需要提高的地方，如數(shù)據(jù)防竄通不夠、尚未體現(xiàn)藥品計數(shù)方法驗證的特點。今后的工作中將不斷完善和改進藥品微生物檢驗檢測能力驗證計劃，進一步提升藥品微生物檢驗檢測工作的水平和能力。