肖安菊,龔達(dá)林,劉三波,余 浩,喻 昕
(1.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北 黃石 435003;2.華潤(rùn)三九(黃石)藥業(yè)有限公司,湖北 黃石 435004)
雷公藤片、雷公藤多苷片為衛(wèi)矛科木質(zhì)藤本植物雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook.f.)的根或根的去皮部位經(jīng)醋酸乙酯提取后制成的片劑。原藥品標(biāo)準(zhǔn)采用中性氧化鋁柱純化后[1],采用HPLC法測(cè)定雷公藤片中雷公藤甲素的含量。大多數(shù)有關(guān)雷公藤藥材或制劑中主要成分含量測(cè)定也較多采用中性氧化鋁柱或硅膠柱純化方法[2-4]。為有效地控制雷公藤半成品、制劑的質(zhì)量,建立了SPE-HPLC法同時(shí)測(cè)定雷公藤片中雷公藤甲素、雷公藤紅素、去甲澤拉木醛和雷公藤內(nèi)酯甲的含量,經(jīng)檢測(cè)其分離較好、檢測(cè)靈敏度高,可作為雷公藤半成品、制劑的質(zhì)量控制方法。
雷公藤半成品(干浸膏、三批)、雷公藤片(批號(hào)18080022、19010012、1910001Z)均由華潤(rùn)三九(黃石)藥業(yè)有限公司提供;雷公藤多苷片購(gòu)自浙江德恩得制藥有限公司(批號(hào)1901114B、1903126B、1903127B),江蘇美通制藥有限公司(批號(hào)190202、171201、190403),上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司(批號(hào)160703、180803、190102)。
甲醇(HPLC級(jí))、乙腈(HPLC級(jí))、磷酸(HPLC級(jí)),德國(guó)Fisher公司;三乙胺(HPLC級(jí)),德國(guó)默克公司;雷公藤甲素(111567-201404,ID:H6RJ-8PRY)、雷公藤紅素(111946-201501,ID:YD5C-3WSR),中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院;去甲澤拉木醛(CAS:107316-88-1,Lot:AF8121402)、雷公藤內(nèi)酯甲(CAS:84104-71-2,Lot:AF8010505)標(biāo)準(zhǔn)品,成都埃法生物科技有限公司;甲醇(分析純),上海展云化工有限公司。
UltiMate3000型高效液相色譜儀(包括四元泵、全自動(dòng)進(jìn)樣儀、DAD檢測(cè)器,美國(guó)Thermo Scientific公司),NAI-FXCQY-24型固相萃取儀(上海那艾精密儀器有限公司),BRP型固相萃取柱(月旭科技(上海)股份有限公司),SB-25-12DT型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司),RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),F(xiàn)A2204C型萬分之一電子天平(上海越平科學(xué)儀器制造有限公司),MS205DU型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
1.4.1 色譜條件 色譜柱Kromecil C18柱,柱溫30℃,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)218、410、210 nm,流動(dòng)相見表1。
表1 雷公藤半成品、制劑使用的流動(dòng)相
1.4.2 供試品溶液的制備
1)雷公藤半成品供試液的制備。精密稱取干浸膏0.05 g,加甲醇8 mL,30℃超聲20 min使溶解,加100μL三乙胺,加甲醇溶液定容。過BRP柱[5](預(yù)先用3 mL甲醇溶液和3 mL水活化),用10 mL乙酸乙酯∶甲醇混合液(10∶5)洗脫,洗脫液40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥,甲醇溶解,于10 mL容量瓶中定容,即得供試品溶液。
2)雷公藤制劑供試液的制備。取雷公藤制劑20粒,精密稱重,研磨成細(xì)粉,取0.5 g,精密稱定,濾紙包裹,置于具塞廣口瓶中,加30 mL甲醇溶液,50 Hz超聲30 min,重復(fù)3次,合并提取液,于80℃水浴蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?,并?0 mL容量瓶中,加100μL三乙胺,后同雷公藤半成品供試液的制備步驟,即得供試品溶液。
分別取適量4種標(biāo)準(zhǔn)品,置于4個(gè)10 mL容量瓶中,加入甲醇溶液分別制成濃度為0.099 0 mg/mL雷公藤甲素、0.995 0 mg/mL雷公藤紅素、0.214 0 mg/mL去甲澤拉木醛、0.158 0 mg/mL內(nèi)酯甲的單標(biāo)貯備液。分別取各單標(biāo)貯備液適量,梯度濃度稀釋進(jìn)樣檢測(cè),回歸方程和線性范圍如表2。對(duì)照品及樣品的色譜圖見圖1。
圖1 4種成分對(duì)照品圖譜和樣品圖譜
表2 4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性范圍
精密稱定雷公藤多苷片粉末0.5 g進(jìn)行色譜檢測(cè),連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果表明,雷公藤甲素RSD為2.68%、去甲澤拉木醛RSD為1.55%、雷公藤紅素RSD為1.94%、雷公藤內(nèi)酯甲R(shí)SD為3.21%。
于0、4、8、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定5次。結(jié)果表明,雷公藤甲素RSD為5.89%、去甲澤拉木醛RSD為4.36%、雷公藤紅素RSD為2.14%、雷公藤內(nèi)酯甲R(shí)SD為3.27%。
精密稱定6份雷公藤多苷片粉末各0.5 g,按照樣品中雷公藤甲素含量的80%、100%、120%加入4種成分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(含雷公藤甲素0.100 8 mg/mL、雷公藤紅素0.194 2 mg/mL、去甲澤拉木醛0.195 2 mg/mL、雷公藤內(nèi)酯甲0.051 9 mg/mL)進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果見表3。
表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果
2.5.1 雷公藤半成品含量測(cè)定 精密稱定3份雷公藤干浸膏各0.05 g,進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果見表4。
表4 雷公藤浸膏中4種成分含量測(cè)定結(jié)果(單位:mg/g)
2.5.2 雷公藤制劑含量測(cè)定 分別稱取3份雷公藤片、雷公藤多苷片各批號(hào)樣品,進(jìn)樣檢測(cè),結(jié)果見表5。
表5 雷公藤制劑中4種成分含量測(cè)定結(jié)果 (單位:mg/g)
雷公藤片、雷公藤多苷片使用藥材部位不同(分別是雷公藤根、去皮根),4種成分的含量差異較大,即使是同種產(chǎn)品,不同廠家的產(chǎn)品4種成分之間也有差異。除去甲澤拉木醛毒性相對(duì)較小外[6,7],其他3種成分都有較強(qiáng)的毒性[8,9],制劑中僅控制雷公藤甲素的含量,不足以有效控制制劑的不良反應(yīng)。本研究利用固相萃取純化技術(shù)代替了傳統(tǒng)手工純化,重現(xiàn)性更好。省時(shí)省力,可作為雷公藤半成品、制劑的質(zhì)量控制方法。
致謝:特別感謝浙江德恩得制藥有限公司銷售經(jīng)理為本研究提供雷公藤多苷片。