楊 凱，王岳松，高銀愛，楊慧君，袁勇超，成為為，魏輝杰，王青云

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水動物養(yǎng)殖重點實驗室，武漢 430070）

銅是脊椎動物包括魚類的必需微量元素，具有多種生理功能，主要作為某些酶的輔助因子，如細胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、賴氨酸氧化酶、多巴胺羥化酶和酪氨酸酶［1］。魚類飼料必須包括能量來源、必需氨基酸、必需脂肪酸、特定維生素和礦物質，以維持生命和促進生長［2］。部分魚類對銅的需求量已經(jīng)被定量化，如鯉魚和虹鱒魚［3］、斑點叉尾鮰［4］、奧尼羅非魚［5］、石斑魚［6］、黃顙魚［7］和藍點石斑［8］。現(xiàn)已有研究表明，飼料中缺乏銅會降低魚的食欲、生長速度、肝臟Cu-Zn SOD和心臟細胞色素氧化酶的活性［4-6，8，9］。且以往的研究也表明，魚類飼料中過量的銅會導致中毒綜合征［5］，包括生長減緩［10］、腸道嚴重損傷［11］以及提高腸道細胞增殖率和凋亡率［12，13］。在飼料中添加銅既要滿足銅的需要，又要避免銅中毒［14］。因其肉質鮮美，且可接受配合飼料并快速生長的特性，赤眼鱒成為中國淡水養(yǎng)殖的一個很好的候選品種［15］。近年來，赤眼鱒最佳的飼料蛋白質和脂肪水平已被確定［16］。然而到目前為止，還沒有關于其飼料銅需要量的定論。因此，本研究旨在探究赤眼鱒幼魚對飼料中銅的適宜需求量，并評估飼料銅水平對其生長性能和體組成的影響，以期補充完善赤眼鱒營養(yǎng)數(shù)據(jù)庫，為開發(fā)赤眼鱒不同生長階段專用飼料提供基礎數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料制備

基礎飼糧（對照組飼糧）組成及營養(yǎng)水平［17］見表1。酪蛋白（國藥集團化學試劑有限公司）、魚油、豆油和糊精（武漢高龍飼料有限公司）分別作為飼糧的蛋白質源、脂肪源和糖源。在基礎飼糧中不添加銅作為對照（干物質基礎含銅0.29 mg/kg）［16］。另外8種試驗處理飼料以CuSO4·5H2O（國藥集團化學試劑有限公司）作為銅源的半純化飼糧中實際銅含量分別為0.29、1.31、2.28、3.43、4.57、6.61、8.77、10.73和12.89 mg/kg。制作飼料時，先將稱取各干料攪拌混合后加入蒸餾水混合，倒入制粒機（F-26（II），華南理工大學）磨制成顆粒狀，在45℃的通風烘箱中烘干12 h。干燥后將其篩分出直徑1.0 mm的顆粒飼料，密封后在-20℃儲存。先用高氯酸消化后，再用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES，VIS?TA-MPX，VARIAN）對飼糧中的銅水平進行分析。在所有飼糧中添加30 g/kg的誘食劑，其與魷魚外套膜組織具有類似化學組成可以增加飼糧適口性［18］。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗魚購自武漢市農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所試驗基地。在飼養(yǎng)試驗開始前，先將赤眼鱒幼魚放置于1 600 L室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖水箱中馴化2周。馴化期內(nèi)，每天8：00和16：00分別投喂對照飼糧兩次。飼養(yǎng)試驗共分9組，每組設置3個重復，每個重復30尾魚。選取810尾健康狀況良好、體型均勻的魚（初始體重為6.22±0.11 g）放置在27個砂濾曝氣后的淡水水箱（300 L）中，每箱放30尾魚。每天分別在8：00和16：00給魚投喂試驗飼料至飽食，記錄每日進料情況，為避免糞便污染，于投料后40 min收集未吃飼料并記錄重量，每天檢查死亡情況。飼養(yǎng)試驗期間維持12 h光照、12 h黑暗，水溫25.6～27.4℃，溶氧量6.7 mg/L，pH 7.4～8.1，總氨氮0.033～0.057 mg/L，定期檢測飼養(yǎng)水中銅含量（1.36±0.41μg/L），養(yǎng)殖周期為8周。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結束后，對每個水箱中魚體稱重并進行組織取樣分析。每個水箱中選8尾魚用三卡因甲烷磺酸鹽（MS-222）麻醉，解剖5尾魚肝臟，并集中分析。肝臟保存在-80℃，用于測定硫代巴比妥酸反應物（TBARS）、銅鋅超氧化物歧化酶（Cu-Zn SOD）活性。

1.4 指標測定及分析

采用標準程序［16］對飼糧中的蛋白質、脂質和灰分進行測定。將肝組織勻漿到9倍體積的冷緩沖液（0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%生理鹽水，pH 7.4）中，4℃下3 000 r/min離心15 min，保存上清液以測定Cu-Zn SOD的活性和MDA的含量。采用BCATM蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定蛋白含量，采用硫代巴比妥酸反應物測試盒（南京建成生物工程研究所）測定丙二醛（MDA）含量。采用ELISA標準方法測定金屬硫蛋白含量［18］。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的Cu-Zn SOD活性測定試劑盒（A001-2）按照說明書測定Cu-Zn SOD活性。用分光光度法測定血清蛋白質濃度［19］。所有分析測定進行3次重復。

1.5 生長指標計算

存活率（SR，%）=100（Nf/Ni），其中，Nf為試驗末期魚成活數(shù)，Ni為試驗初期魚成活數(shù)；增重率（WG，%）=100［（Wf-Wi）/Wi］，其中，Wf為末期魚體重，Wi為試驗初期魚體重；特定生長率（SGR，%/d）=100（lnWf-lnWi）/T，其中，Wf試驗末期魚體重，Wi為試驗初期魚體重，T為試驗周期；飼料系數(shù)（FCR）=WF/（Wf-Wi），其中，WF為攝食量；蛋白質效率（PER，%）=（Wf-Wi）/WF×Wp，其中，Wp為飼料中蛋白質含量；全體銅蓄積量（μg）=（Cf-Ci，μg）-（CF，μg）［5］，其中，Cf為試驗末期魚全體銅含量，Ci為試驗初期魚全體銅含量，CF為銅攝入量；肥滿度（CF，%）=100Wf/L3，其中，L為魚體長；肝體比（HSI，%）=100（WH/W），其中，WH為肝臟重；臟體比（VSI，%）=100（WV/W），其中，WV為內(nèi)臟重。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，結果以3次重復的平均值±標準誤表示。通過單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗各數(shù)據(jù)之間的方差和顯著差異，若差異性顯著采用鄧肯氏多重比較檢驗P＜0.05顯著性水平的均值。對試驗魚全體銅蓄積量進行二次曲線回歸分析，對WG和FCR進行線性回歸分析以評估赤眼鱒幼魚對飼糧中銅的需要量。

2 結果與分析

喂食對照飼糧（0.29 mg/kg飼料銅組）的試驗魚出現(xiàn)典型的飼糧銅缺乏癥狀，如生長不良和骨骼畸形。各試驗飼糧飼養(yǎng)下魚的生長性能、形態(tài)指標和存活情況如表2所示。飼喂對照飼糧的試驗魚的SGR明顯低于飼喂其他飼糧的魚。4.57 mg/kg飼料銅組的魚SGR最高（1.68%/d），但在低銅水平和高銅水平時均有下降（P＜0.05）。PER與SGR的變化趨勢相似。相反，飼糧銅水平為0.29 mg/kg時，F(xiàn)CR最低。通過線性回歸模型分析，可以很好地表現(xiàn)飼糧中銅水平與WG之間的關系，赤眼鱒生長性能最佳飼糧銅水平為4.79 mg/kg（圖1）。對試驗魚的FCR進行折線回歸分析表明，飼糧中銅的適宜需要量為4.92 mg/kg（圖2）。飼喂對照飼糧的試驗魚SR低于飼喂銅水平≤10.73 mg/kg飼糧的魚。飼糧銅水平對VSI和HSI有顯著影響（P＜0.05，表2），對CF卻沒有顯著影響（P＞0.05）。

表2 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚生長性能、形態(tài)指標和存活情況的影響

圖1 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚增重的影響

圖2 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚飼料系數(shù)的影響

由表3可以看出，飼糧銅水平也顯著影響赤眼鱒的體組成（P＜0.05）。其體脂肪含量隨飼糧銅水平的升高而降低（P＜0.05）。隨著飼糧銅水平的增加，全體銅蓄積量顯著增加（P＜0.05）（表4）。對全體銅蓄積量和飼糧銅水平進行線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)飼糧中銅的適宜需求量為3.94 mg/kg（圖3）。

圖3 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚全體銅蓄積量的影響

表3 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚體組成和銅含量的影響

表4 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚全體銅蓄積量的影響

肝臟銅濃度隨飼糧銅水平的增加而顯著（P＜0.05）增加（表5）。飼糧銅水平對赤眼鱒肝臟中TBARS濃度有顯著影響（P＜0.05）。各組中，飼喂對照日糧的魚的TBARS值最高（表5）。飼糧銅水平對肝臟Cu-Zn SOD活性有顯著影響（P＜0.05），低銅含量飼糧和高銅含量飼糧對肝臟Cu-Zn SOD活性的影響顯著（P＜0.05）低于3.43 mg/kg飼糧和4.57 mg/kg飼糧。

表5 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚肝臟Cu-Zn SOD活性、TBARS值和銅濃度的影響

3 討論

本研究結果表明飼糧中銅水平對赤眼鱒幼魚的生長性能有顯著影響，以4.57 mg/kg飼料銅組飼糧飼養(yǎng)的試驗魚SGR最高。在石斑魚和黃顙魚中也發(fā)現(xiàn)了類似的結果［7，20］。飼養(yǎng)魚類時飼糧銅缺乏或過量都會生長緩慢，這與其他水生動物一致［21，22］。對照組魚體FCR和PER值最低，但與12.89 mg/kg飼料銅組魚體FCR和PER值無顯著性差異。同樣，較低或較高的飼糧銅水平會影響黃顙魚和斑點叉尾鮰的生長和飼料利用［7，23］。有研究表明，飼糧銅缺乏會抑制羅非魚和石斑魚的食欲和生長［5，6］，而魚體內(nèi)銅含量過高會導致中毒綜合征［11，13］，包括生長減緩［10］、腸道細胞增殖和代謝的微妙變化［12，13］以及腸道的嚴重損傷［11］。因此，在魚飼料中補充銅是滿足銅需求和避免銅毒性之間的平衡［14］。

對WG進行折線回歸分析，赤眼鱒幼魚對飼糧中銅的最佳需求量為4.79 mg/kg。以生長和生化指標作為評價指標，赤眼鱒飼糧銅需求量與有鰭魚相似（3～6 mg/kg）［4-6，23，24］。魚類對銅的最適需要量與魚種、攝食方式和生長階段有關［10］。通過對試驗魚FCR進行折線回歸分析，赤眼鱒幼魚對飼糧中銅的最佳需求量為4.92 mg/kg。

在本研究中不論是攝入不足或過量銅的赤眼鱒幼魚，其VSI和HSI均顯著降低。Wu等［22］報道，當飼糧銅水平≥12.22 mg/kg時甲魚肝臟出現(xiàn)縮小，HSI顯著降低，清楚地證明了該濃度下的銅水平會對甲魚產(chǎn)生不利影響。但關于魚和蝦的報道顯示其肝臟銅含量和HSI呈正相關［21，25］。在本研究中VSI和HSI的降低可能是由于這些組攝食減少或機體為解毒和維持體內(nèi)平衡而增強代謝所致。

隨著飼糧銅水平的增加，試驗魚全體銅蓄積量顯著下降，這種現(xiàn)象在其他研究中也有報道［5-6，25］。肝臟是魚類主要的銅儲存器官［24，26］。在本研究中飼糧中銅含量顯著影響了赤眼鱒的體組成。脂肪、蛋白質和銅的組織沉積依賴于飼料攝入量、代謝利用和腸道吸收，而這些因素都可能受到飼糧中銅水平升高的影響［27］。Handy等［28］提出與食用11 mg/kg銅水平的干性飼料的魚相比，食用500 mg/kg銅水平的干性飼料1個月后，虹鱒魚的脂肪儲存顯著下降。本研究中赤眼鱒全體和肝臟銅蓄積量隨飼糧中銅水平的增加而增加，表明赤眼鱒可能在組織中積累過量的銅。一般來說，當魚被喂食高濃度銅7 d或更長時間后，高濃度銅會在腸組織、肝臟和膽囊積聚，而在鰓、肌肉和腎臟積聚的銅濃度較低［29-31］。

SOD作為一種抗氧化酶，在保護細胞免受自由基損傷方面發(fā)揮著重要作用［32，33］。SOD是一種銅依賴酶，已經(jīng)被證明是一個很好的研究大鼠和貓銅營養(yǎng)需求的評價指標［34，35］。Gatlin等［4］也報道了喂養(yǎng)0～2.0 mg/kg銅水平飼料的斑點叉尾鮰肝臟中Cu-Zn SOD活性明顯低于喂養(yǎng)4 mg/kg銅水平飼料的斑點叉尾鮰。本研究結果表明飼糧中低劑量銅（≤2.28 mg/kg）和高劑量銅（≥6.61 mg/kg）都會降低赤眼鱒肝臟Cu-Zn SOD活性。TBARS是通過檢測脂質氧化來評價氧化應激的常用指標之一［36］。肝臟TBARS值與肝臟Cu-Zn SOD活性呈負相關。飼糧中低劑量銅和高劑量銅都會升高試驗魚肝臟TBARS值，可能是由于Cu-Zn SOD活性較低所致。

通過對試驗魚WG、FCR線性回歸分析和魚體銅蓄積量的二次曲線回歸分析，赤眼鱒幼魚的最適飼糧銅需求量為3.94～4.92 mg/kg。飼糧中銅的缺乏或過量都會顯著降低赤眼鱒幼魚的生長速度和攝食量。飼糧中的銅會使赤眼鱒幼魚肝臟蓄積銅，并表現(xiàn)出毒性作用。