索鈺杰，林 格，江 南，李逸群，范玉頂 ，劉文枝，孟 彥，薛明洋，曾令兵，周 勇

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

大鯢(Andriasdavidianus)俗稱“娃娃魚”，隸屬有尾目(Caudata)隱鰓鯢科(Cryptobranchidae)大鯢屬(Andrias)，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動(dòng)物，具有很高的科研與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]。隨著大鯢養(yǎng)殖技術(shù)的日趨成熟、規(guī)模的持續(xù)擴(kuò)大、集約化程度的不斷提高，大鯢養(yǎng)殖過程中的病害問題日益突出[3-4]。其中，由大鯢虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)引起的大鯢病毒性疾病危害最為嚴(yán)重，死亡率最高達(dá)100%，給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

疫苗免疫被認(rèn)為是預(yù)防大鯢虹彩病毒病發(fā)生的最有效途徑[6-9]。曾憲輝等[6]以GSIV的主衣殼蛋白(major capsid protein,MCP)為靶點(diǎn)構(gòu)建的DNA疫苗，在免疫后28 d仍可從大鯢的肌肉、肝、脾和腎組織中檢出MCP基因，該DNA疫苗的相對(duì)免疫保護(hù)率為73.3%。Zhou等[7]根據(jù)酵母密碼子偏好性優(yōu)化GSIV MCP基因序列后，利用酵母表達(dá)了MCP蛋白，將蛋白純化后免疫大鯢，其相對(duì)保護(hù)率可達(dá)78.0%。Liu等[8]使用1.0×106TCID50/mL的劑量滅活疫苗免疫大鯢，其相對(duì)免疫保護(hù)效力為72.0%，證明了滅活疫苗也有較好的免疫保護(hù)效果。孫建濱等[9]用β-丙內(nèi)酯滅活病毒制備了大鯢虹彩病毒滅活疫苗，明確了滅活的最適條件為0.1%的β-丙內(nèi)酯于4 ℃滅活細(xì)胞培養(yǎng)的GSIV 72 h。雖然已有多種疫苗被證實(shí)能有效的預(yù)防大鯢虹彩病毒病，但由于疫苗的安全性和免疫效力研究不完善，制約了上述疫苗的產(chǎn)業(yè)化與推廣，因此未能從根本上解決大鯢虹彩病毒病對(duì)大鯢養(yǎng)殖業(yè)的影響。

本研究以大鯢虹彩病毒滅活疫苗為對(duì)象，探究疫苗的不同免疫劑量、免疫時(shí)間、免疫次數(shù)對(duì)大鯢的安全性以及免疫后大鯢體內(nèi)相關(guān)免疫基因的表達(dá)特征、血清中和抗體滴度與免疫保護(hù)效果，以期為大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的產(chǎn)業(yè)化推廣提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鯢

大鯢來源于湖北龍興水產(chǎn)生物科技有限公司，9月齡，平均體重為(29.31±5.14)g，體長(zhǎng)(15.62±5.20)cm。將大鯢飼養(yǎng)于規(guī)格為80 cm(長(zhǎng))×60 cm(寬)×15 cm(高)的塑料周轉(zhuǎn)箱中，養(yǎng)殖室內(nèi)溫度維持在20～22 ℃，養(yǎng)殖期間投喂新鮮魚肉，每天換水一次。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)抽樣大鯢，采用PCR方法檢測(cè)GSIV，確認(rèn)GSIV陰性后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 病毒及細(xì)胞系

大鯢虹彩病毒(GSIV)由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；鯉上皮瘤細(xì)胞系(Epithelioma papulosum cyprin,EPC)來自于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC GDC0174。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物及反應(yīng)程序

設(shè)計(jì)大鯢β-Actin、MyD88、TLR9和MHCIIA基因的熒光定量PCR引物(表1)，由武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成。采用Trizol Reagent提取大鯢組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性25 s；55 ℃退火25 sec；72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增引物

1.4 大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的制備

于T75細(xì)養(yǎng)瓶中(Corning,USA)培養(yǎng)EPC細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合單層，以GSIV感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為0.5的感染劑量接種EPC細(xì)胞，25 ℃培養(yǎng)并逐日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)，待細(xì)胞病變大于80%時(shí)收獲病毒。于96孔板中測(cè)定病毒的TCID50，將收獲的病毒液分為兩份，一份用于攻毒實(shí)驗(yàn)和血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定。另一份病毒液用緩沖液(PBS)稀釋至1.0×106TCID50/mL后，加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的β-丙內(nèi)酯，4 ℃滅活72 h，即成大鯢虹彩病毒病滅活疫苗，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 疫苗安全性實(shí)驗(yàn)

取健康大鯢180尾，平均分為6組，分別為：一次單劑量免疫組、超劑量免疫組、單劑量重復(fù)免疫組和3組對(duì)照，各組大鯢在相同條件下隔離飼養(yǎng)。暫養(yǎng)一周后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組通過腹腔注射途徑，分別注射疫苗和PBS。一次單劑量免疫組注射0.2 mL滅活疫苗，超劑量免疫組注射1 mL滅活疫苗，單劑量重復(fù)免疫組連續(xù)注射3次0.2 mL滅活疫苗(每天注射1次)，分別設(shè)置對(duì)照組(注射PBS)。每日觀察實(shí)驗(yàn)大鯢的攝食和活動(dòng)情況，14 d后剖檢觀測(cè)臟器。

1.6 最小免疫劑量的測(cè)定

取健康大鯢360尾，隨機(jī)分為6組，分別為5個(gè)免疫組和1個(gè)對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)疫苗隨機(jī)取樣，采用腹腔注射接種途徑，分別按照0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/尾的免疫劑量對(duì)大鯢進(jìn)行免疫；對(duì)照組每尾注射0.5 mL的PBS，作為非免疫對(duì)照。免疫后第2 、4 、7 、14 、21 和28 天，從不同劑量免疫組與對(duì)照組中各取3尾大鯢，尾靜脈取血，用于血清抗體效價(jià)的測(cè)定；采集脾臟，提取脾臟總RNA，檢測(cè)樣品中MyD88、TLR9和MHCIIA基因表達(dá)量的變化。將待檢測(cè)的血清在56 ℃水浴30 min，用M199培養(yǎng)基將血清稀釋10倍后，按2倍等比稀釋，即血清從1∶10稀釋至1∶1 280，取50 μL不同稀釋度的血清與50 μL 100 TCID50/0.1 mL的GSIV病毒液在96孔板中混合，每個(gè)血清稀釋濃度設(shè)六個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陽性與陰性對(duì)照孔。混勻后置于25 ℃培養(yǎng)箱中孵育，每隔20 min混勻一次，2 h后每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液，置25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察結(jié)果，以Reed-Muench 法計(jì)算血清的中和抗體滴度。免疫28 d后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鯢腹腔注射大鯢虹彩病毒0.3 mL(1.0×107TCID50/mL)，每天觀察并記錄攻毒后大鯢的臨床癥狀、剖檢變化及死亡情況，連續(xù)觀察14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定疫苗的相對(duì)保護(hù)率(relative percent survival，RPS)。

RPS =( 1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)×100%

1.7 疫苗免疫期的測(cè)定

取健康大鯢130尾，隨機(jī)分為2組，1個(gè)免疫組和1個(gè)對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)疫苗隨機(jī)取樣，采用腹腔注射接種途徑，免疫組65尾，每尾注射0.2 mL滅活疫苗；對(duì)照組65尾，每尾注射0.2 mL的PBS。免疫后第35、42、49、56、90、120和150天，從免疫組與對(duì)照組中各取3尾，尾靜脈取血，用于血清抗體效價(jià)的測(cè)定；采集脾臟，提取脾臟總RNA，檢測(cè)樣品中MyD88、TLR9和MHCIIA基因表達(dá)量的變化。免疫150 d后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鯢腹腔注射大鯢虹彩病毒0.3 mL(1.0×107TCID50/mL)，每天觀察并記錄攻毒后大鯢的臨床癥狀、剖檢變化及死亡情況，連續(xù)觀察14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定疫苗的相對(duì)保護(hù)率。

1.8 第二次免疫最小間隔期的測(cè)定

取健康大鯢600尾，分別隨機(jī)分為10組，分別為5個(gè)免疫組和5個(gè)對(duì)照組。將試驗(yàn)疫苗隨機(jī)取樣，采用腹腔注射接種途徑，免疫組300尾，每尾注射2次0.2 mL滅活疫苗(1.0×106TCID50/mL)；對(duì)照組300尾，每尾在一次免疫時(shí)注射0.2 mL的滅活疫苗(1.0×106TCID50/mL)，但二次免疫時(shí)注射0.2 mL PBS。免疫組和對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行一次免疫，在第一次免疫后的第7、14、21、28和56 d分別對(duì)免疫組和對(duì)照組進(jìn)行第二次免疫，并在二次免疫后的第7、14、21、28、56、90、120和150 d，隨機(jī)從免疫組與對(duì)照組中各取3尾，尾靜脈取血，用于血清抗體效價(jià)的測(cè)定；采集脾臟，提取脾臟總RNA，檢測(cè)樣品中MyD88、TLR9和MHCIIA基因表達(dá)量的變化。在第二次免疫150 d后試驗(yàn)組連同對(duì)照組的每尾大鯢各腹腔注射大鯢虹彩病毒0.3 mL(1.0×107TCID50/mL)，每天觀察并記錄攻毒后大鯢的臨床癥狀、剖檢變化及死亡情況，連續(xù)觀察14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算二次免疫后大鯢的存活率。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS21.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析進(jìn)行組間差異性分析，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗安全性實(shí)驗(yàn)

大鯢經(jīng)腹腔注射單劑量、超劑量和單劑量重復(fù)的大鯢虹彩病毒病滅活疫苗，通過14 d觀察，免疫動(dòng)物攝食和活動(dòng)行為均正常，未出現(xiàn)臨床癥狀以及局部反應(yīng)。接種14 d后，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鯢剖檢發(fā)現(xiàn)，注射部位、肌肉及內(nèi)臟器官未見異常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鯢虹彩病毒病滅活疫苗對(duì)大鯢的安全性較好。

2.2 最小免疫劑量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 血清中和抗體效價(jià)結(jié)果

以不同劑量的疫苗免疫大鯢后，免疫組和對(duì)照組大鯢的血清抗體效價(jià)的變化如圖1所示。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組的血清抗體效價(jià)一直維持在1 ∶2左右，而免疫組的血清抗體效價(jià)隨免疫劑量的增加而增加。0.1 mL劑量組血清抗體效價(jià)明顯低于其它實(shí)驗(yàn)組，0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL劑量組的血清抗體效價(jià)相近，且差異較小。不同劑量免疫組的血清抗體效價(jià)都在免疫后第21 d達(dá)到最高值，0.1 mL時(shí)大鯢的血清抗體效價(jià)121.10±26.62，極顯著高于對(duì)照組，而其他免疫劑量組的血清抗體效價(jià)，在252.48±28.01和265.03±29.23之間，極顯著高于對(duì)照組。

圖1 不同劑量疫苗免疫大鯢后的血清抗體效價(jià)

2.2.2 免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化

免疫大鯢虹彩病毒病滅活疫苗后，MyD88、TLR9和MHCIIA基因在脾臟中的表達(dá)量均有上升，3種免疫基因的表達(dá)變化如圖2所示。免疫劑量越高，各免疫相關(guān)基因表達(dá)量上升的幅度越大，且不同劑量的同一免疫相關(guān)基因表達(dá)含量的變化趨勢(shì)相同，0.1 mL實(shí)驗(yàn)組免疫基因上調(diào)幅度最小，而其它4組實(shí)驗(yàn)組免疫基因上調(diào)幅度相近。免疫后第7 dMyD88基因達(dá)到峰值，0.1 mL免疫組升高1.99倍，0.2～0.5 mL免疫組升高范圍為2.78～3.08倍；免疫后第4 dTLR9基因達(dá)到峰值，0.1 mL免疫組升高2.11倍，0.2～0.5 mL免疫組升高范圍為2.78～3.30倍；免疫后第4 dMHCIIA基因達(dá)到峰值，0.1 mL免疫組升高1.93倍，0.2～0.5 mL免疫組升高范圍為2.58～2.85倍，與對(duì)照組相比，均有顯著性差異。

圖2 不同劑量疫苗免疫大鯢后的相關(guān)免疫基因表達(dá)量的變化

2.2.3 相對(duì)免疫保護(hù)率

免疫不同劑量大鯢虹彩病毒病滅活疫苗28 d后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鯢和對(duì)照組大鯢進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其相對(duì)免疫保護(hù)率。0.1 mL免疫組，疫苗的相對(duì)免疫保護(hù)率為44.44%；0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL免疫組疫苗的相對(duì)免疫保護(hù)率相同，均為72.22%；0.5 mL免疫組，疫苗的相對(duì)免疫保護(hù)率為77.78%(圖3)。

圖3 大鯢最小免疫劑量實(shí)驗(yàn)相對(duì)免疫保護(hù)率

2.3 免疫持續(xù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 血清中和抗體效價(jià)結(jié)果

免疫0.2 mL大鯢虹彩病毒病滅活疫苗后，檢測(cè)大鯢的血清抗體效價(jià)在150 d內(nèi)的變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。對(duì)照組的血清抗體效價(jià)一直維持在1∶2左右，實(shí)驗(yàn)組的血清抗體效價(jià)呈現(xiàn)為先快速升高后保持相對(duì)穩(wěn)定的趨勢(shì)。免疫7 d后血清抗體效價(jià)開始顯著增高，21 d實(shí)驗(yàn)組的血清抗體效價(jià)上升到最高水平252.48±28.01，極顯著高于對(duì)照組。血清抗體效價(jià)在28 d到120 d維持穩(wěn)定，從150 d開始下降，但仍顯著高于對(duì)照組大鯢的血清抗體效價(jià)。

圖4 大鯢虹彩病毒病疫苗免疫大鯢后血清抗體效價(jià)的變化

2.3.2 免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化

免疫0.2 mL大鯢虹彩病毒病滅活疫苗后，檢測(cè)150 d內(nèi)大鯢脾臟中MyD88、TLR9和MHCIIA基因的表達(dá)情況。MyD88基因在免疫第7 d時(shí)達(dá)到峰值，TLR9基因在第4 d達(dá)峰值，MHCIIA基因在第4 d達(dá)到峰值(圖5)。實(shí)驗(yàn)組的免疫基因表達(dá)呈現(xiàn)先快速升高后下降的趨勢(shì)，下降后免疫基因表達(dá)量略高于對(duì)照組。

圖5 大鯢虹彩病毒病滅活疫苗免疫大鯢后相關(guān)免疫基因表達(dá)量的變化

2.3.3 相對(duì)免疫保護(hù)率

免疫0.2 mL大鯢虹彩病毒病滅活疫苗150 d后，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的大鯢進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)免疫保護(hù)率為62.5%(圖6)。

圖6 攻毒后大鯢的死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率

2.4 第二次免疫最小間隔期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 第二次免疫血清中和抗體效價(jià)結(jié)果

在不同第二次免疫間隔期實(shí)驗(yàn)組中，大鯢血清抗體效價(jià)的變化如表2所示。在一次免疫后第7 d或第14 d后進(jìn)行第二次免疫，血清抗體效價(jià)都呈現(xiàn)出先增高后持平趨勢(shì)，分別在二次免疫后的第7 d和第14 d血清抗體效價(jià)開始增高，在二次免疫后的第90 d達(dá)到最高值，最高值分別為261.38±18.23和265.03±22.34；在一次免疫后第21 d、28 d和56 d后進(jìn)行二次免疫，血清抗體效價(jià)整體持平，但高于一次免疫時(shí)的最高血清抗體效價(jià)，一次免疫后的21 d進(jìn)行二次免疫，可以最快達(dá)到最高血清抗體效價(jià)，最高值為274.37±25.23，極顯著高于對(duì)照組。

表2 不同二次免疫間隔期免疫后大鯢的血清抗體效價(jià)

2.4.2 免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化

第二次免疫后MyD88、TLR9和MHCIIA基因均呈現(xiàn)出先升高后降低并持平的趨勢(shì)(圖7)。不同間隔期二次免疫后，免疫基因均呈先增高后下降的趨勢(shì)。一次免疫后21 d進(jìn)行二次免疫，MyD88、TLR9和MHCIIA基因的變化趨勢(shì)最明顯，二次免疫后第7 d免疫基因的增幅達(dá)到峰值，MyD88基因增高2.09倍，TLR9基因增高2.52倍，MHCIIA基因增高1.68倍，均顯著高于對(duì)照組。

圖7 一次免疫后不同時(shí)間二次免疫大鯢后的相關(guān)免疫基因表達(dá)量的變化

2.4.3 第二次免疫的存活率

在第二次免疫后150 d對(duì)大鯢進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其存活率。一次免疫間隔7 d后和14 d后進(jìn)行二次免疫的存活率都為66.67%。一次免疫間隔21 d后和28 d后進(jìn)行二次免疫，其存活率分別為86.67%和80.00%。一次免疫間隔56 d后進(jìn)行二次免疫的存活率為76.67%(表3)。

表3 大鯢第二次免疫最小間隔期實(shí)驗(yàn)存活率

3 討論

疫苗免疫選擇合適的免疫年齡至關(guān)重要，因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)在年齡較小時(shí)尚未發(fā)育成熟，無法產(chǎn)生有效的保護(hù)力，所以接種滅活疫苗的年齡不宜太小[10]。Jiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)大鯢部分與免疫相關(guān)的器官在6月齡至9月齡發(fā)育完全。歐燎原[12]發(fā)現(xiàn)9月齡時(shí)，幼鯢體型上與成鯢一致，基本發(fā)育完全，外鰓呼吸功能萎縮并逐步脫落，但因?yàn)闄C(jī)體免疫和自我防御能力的下降，幼鯢極易患病。為了大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的高效利用，本研究選擇9月齡的大鯢開展疫苗的安全性與免疫效力的研究。

安全性是疫苗最為重要的數(shù)據(jù)，對(duì)疫苗開展安全性評(píng)價(jià)是任何一個(gè)新疫苗在研發(fā)階段或者推向市場(chǎng)之前都必須要進(jìn)行的[13]。崔艷麗[14]在研制了雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感(H9亞型)四聯(lián)滅活疫苗(LaSota株+M41株+HS25株+HZ株)后，從單劑量接種、單劑量重復(fù)接種和一次性超劑量接種三個(gè)方面證明了疫苗的安全性，為疫苗的有效使用提供了安全保障。本研究對(duì)大鯢進(jìn)行了一次單劑量接種、單劑量重復(fù)接種和超劑量接種實(shí)驗(yàn)，接種疫苗后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)大鯢攝食和行為正常，均未出現(xiàn)臨床癥狀以及局部反應(yīng)，剖檢實(shí)驗(yàn)大鯢后觀察發(fā)現(xiàn)，注射部位、肌肉及臟器未見異常，證明該疫苗安全。

過小的免疫劑量不能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生充足的免疫力[15]。疫苗的免疫效果好、副反應(yīng)小和生產(chǎn)成本少是疫苗生產(chǎn)應(yīng)用與推廣的關(guān)鍵參數(shù)。王曉麗等[16]將兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)蜂膠滅活疫苗以0.25、0.5和1 mL/只三種不同劑量組免疫健康易感兔，其測(cè)得最小免疫劑量為0.5 mL/只；劉澤文等[17]以1.2、1.6、2.0和2.4 mL的仔豬紅黃痢疫苗免疫懷孕母豬，確定疫苗的最小免疫劑量為1.6 mL。本研究采用0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL/尾的大鯢虹彩病毒病滅活疫苗，對(duì)健康大鯢免疫，28 d后對(duì)其進(jìn)行攻毒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同免疫劑量均能觸發(fā)大鯢產(chǎn)生保護(hù)率，免疫劑量越高，血清抗體效價(jià)越高，免疫基因表達(dá)量上調(diào)幅度越大，相對(duì)免疫保護(hù)率也越高。當(dāng)免疫劑量為0.2 mL及以上時(shí)對(duì)大鯢虹彩病毒的攻毒保護(hù)率均不低于70%，因此確定該疫苗的最小免疫劑量為0.2 mL/尾，為生產(chǎn)中免疫程序的合理制定提供參考依據(jù)。

疫苗免疫動(dòng)物后刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從應(yīng)答產(chǎn)生到免疫力產(chǎn)生需要一定的時(shí)間[18]。通過實(shí)驗(yàn)確定疫苗免疫產(chǎn)生時(shí)間和免疫持續(xù)時(shí)間可以幫助了解疫苗免疫后何時(shí)能產(chǎn)生有效保護(hù)，從而在免疫效力未達(dá)到或低于保護(hù)水平時(shí)可采取加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、調(diào)整免疫程序提前免疫或加強(qiáng)免疫等措施來減少免疫空白期及低下期的產(chǎn)生[19]。李杰等[20]研究了鰻弧菌(Vibrioanguillarum)O1/O2血清型二價(jià)滅活疫苗免疫大菱鲆后的免疫保護(hù)期，發(fā)現(xiàn)大菱鲆獲得的免疫保護(hù)持續(xù)期大于150 d。本研究在免疫后150 d測(cè)定其攻毒保護(hù)水平，測(cè)得大鯢的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為62.5%。研究結(jié)果表明MyD88基因在免疫第7 d時(shí)達(dá)到峰值，TLR9基因、MHCIIA基因在第4 d時(shí)達(dá)到峰值，免疫21 d以后血清抗體效價(jià)達(dá)到最高值252.48±28.01，表明大鯢免疫21 d后可以建立預(yù)期的免疫保護(hù)。

二次免疫能夠提高宿主的抗體水平、延長(zhǎng)抗體持續(xù)時(shí)間,從而延長(zhǎng)疫苗的免疫保護(hù)期[21-22]。丁山等[21]研究鰻弧菌三價(jià)滅活疫苗對(duì)大菱鲆的保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)二次免疫后，大菱鲆的相對(duì)免疫保護(hù)率高于70%，一次免疫的有效免疫保護(hù)期不低于120 d，二次免疫的有效免疫保護(hù)期不低于150 d?？祷埚蔚萚22]研究堆型艾美耳球蟲疫苗蟲株發(fā)現(xiàn)二次免疫可使抗體水平迅速提高，在最適時(shí)間進(jìn)行二次免疫，對(duì)雛雞有促生長(zhǎng)作用，并可增強(qiáng)免疫力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二次免疫間隔為7 d時(shí)可達(dá)到良好的免疫效果；本研究分別于一次免疫后的第7、14、21、28和56 d進(jìn)行二次免疫，研究結(jié)果表明，一次免疫后21 d進(jìn)行二次免疫血清抗體效價(jià)可以最快達(dá)到最高水平274.37±25.23，相關(guān)免疫基因的表達(dá)也能較快達(dá)到最高水平并且維持較長(zhǎng)時(shí)間。一次免疫后14、21、28和56 d進(jìn)行二次免疫，大鯢的存活率均高于一次免疫后的存活率。因此，確定大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的二次免疫最小間隔期為21 d。大鯢虹彩病毒病滅活疫苗二次免疫時(shí)間的確定，有效提高了疫苗的免疫效力和延長(zhǎng)了疫苗的保護(hù)時(shí)間。

綜上所述，本文圍繞大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的安全性與免疫效力開展了系統(tǒng)的研究，明確了疫苗的安全性，確定了大鯢虹彩病毒病疫苗的最小免疫劑量為0.2 mL/尾、二次免疫最小間隔期為21 d，為大鯢虹彩病毒病滅活疫苗的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。