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        加州鱸致病性鐮刀菌的分離鑒定及其藥物敏感性分析

        2021-07-15 12:13:48于交平馮國(guó)清梁志凌劉振興馬艷平馬江耀
        淡水漁業(yè) 2021年4期
        關(guān)鍵詞:生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

        于交平,羅 蒙,馮國(guó)清,梁志凌,劉振興,郝 樂(lè),馬艷平,馬江耀,柯 浩

        (1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所水產(chǎn)病害研究室,廣州 510000;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,廣州 510000;4.廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510000)

        加州鱸學(xué)名大口黑鱸(Micropterussalmoides),是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種之一[1]。2019年養(yǎng)殖總量477 808 t,廣東省產(chǎn)量超過(guò)270 000 t,居全國(guó)第一[2]。但是由于養(yǎng)殖面積不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖密度逐年增加,苗種、飼料質(zhì)量參差不齊和濫用藥物,加州鱸的各種病害問(wèn)題日益凸顯,其中細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲(chóng)病害相關(guān)報(bào)道較多[3-6],而真菌性疾病研究較少[7]。

        鐮刀菌(Fusarium)作為一種植物致病菌被人們所熟知,可引起多種植物的枯萎、腐爛等[8],某些菌種也會(huì)誘發(fā)人類(lèi)皮膚、角膜炎癥和惡性腫瘤[9]。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的危害日趨嚴(yán)重。1960年H?rter[10]首次從瀕死鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)分離到黃色鐮刀菌(F.culmorum),病魚(yú)體表有大量的白色覆蓋物。此后,陸續(xù)有真鯛(Pagrusmajor)[11]、加州鱸[7]、鯽(Carassiusauratus)[12]等感染鐮刀菌的報(bào)道。目前治療鐮刀菌病的化學(xué)藥物孔雀石綠被禁用,K制劑、龍膽紫等毒性較大,因此通過(guò)篩選出有抑菌效果的藥物,可為今后水產(chǎn)臨床藥物申報(bào)提供參考依據(jù)[13]。2019年7月,廣州某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的加州鱸頭部、胸鰭、尾部出現(xiàn)充血發(fā)炎,隨后逐漸潰爛,并附有白色絲狀物,最終不斷死亡。本實(shí)驗(yàn)組從瀕死加州鱸患病部位分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌。對(duì)其進(jìn)行了鑒定、藥物敏感性檢測(cè)和生理特性研究,旨在為加州鱸病害的臨床診斷和防控提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        健康加州鱸購(gòu)自廣州某公司,體長(zhǎng)(119.23±11.93)mm,體質(zhì)量(20.77±5.09)g,體表無(wú)損傷,置于室外水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)暫養(yǎng)7 d,水溫(28±2)℃,每天按體重1%投喂飼料。觀察并確認(rèn)無(wú)發(fā)病和死亡現(xiàn)象后移入室內(nèi)水族箱(50 cm×40 cm×28 cm),水溫(25±0.5)℃,24 h不間斷曝氣。

        1.1.2 藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株

        近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)(ATCC 22019)由美國(guó)菌種保藏中心提供。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 致病菌的分離純化

        取瀕死魚(yú)患病部位,75%酒精浸洗2~3 s后無(wú)菌水沖洗3~4次,接種于PDA平板上,25 ℃恒溫培養(yǎng)。將出現(xiàn)的菌絲轉(zhuǎn)置新的PDA平板,直到培養(yǎng)物純凈為止。

        1.2.2 致病菌的觀察

        切取小塊培養(yǎng)物,分別放在PDA、CMC、SDA平板上,觀察不同培養(yǎng)基菌落特征。取適量菌絲,鏡檢,觀察菌絲、孢子等形態(tài)學(xué)特征。

        1.2.3 致病菌的鑒定

        使用Fungal DNA Kit提取真菌DNA。采用真菌通用引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG、ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序:預(yù)變性94 ℃ 3 min;變性94 ℃ 30 s,退火55℃ 45s,延伸72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);終延伸72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),交由北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì),選取同源性較高的序列,用MEGA 7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

        1.2.4 致病菌的人工感染實(shí)驗(yàn)

        孢子液制備參照文獻(xiàn)[14]。

        取60尾加州鱸隨機(jī)平均放入4個(gè)水族箱。腹腔注射實(shí)驗(yàn)組每尾魚(yú)按0.2 mL注射濃度為1×107個(gè)/mL孢子液,對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水,以體表充血發(fā)炎判斷為感染。創(chuàng)傷感染實(shí)驗(yàn)組將每尾魚(yú)體表劃傷,置于含1×107個(gè)/mL孢子的水中,對(duì)照組劃傷置于自來(lái)水中,以體表有菌絲附著判斷為感染。每天觀察、記錄感染和死亡情況,計(jì)算感染率和死亡率。

        感染率=(感染魚(yú)數(shù)/實(shí)驗(yàn)魚(yú)總數(shù))×100%,

        死亡率=(死亡魚(yú)數(shù)/實(shí)驗(yàn)魚(yú)總數(shù))×100%。

        1.2.5 不同濃度的孢子液人工感染實(shí)驗(yàn)

        孢子液制備同1.2.4,梯度稀釋至1×102(T1組)、1×103(T2組)、1×104(T3組)、1×105(T4組)、1×106(T5組)、1×107個(gè)/mL(T6組)。

        取健康的加州鱸105尾隨機(jī)平均放入7個(gè)水族箱。6個(gè)濃度組按0.2 mL腹腔注射孢子液,對(duì)照組(C組)注射等量生理鹽水。每天觀察和記錄死亡情況。利用Probit法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)[15]。

        1.2.6 致病菌藥敏試驗(yàn)

        采用瓊脂稀釋法和微量液體稀釋法,測(cè)定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)[16]。質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌。

        1.2.6.1 抗真菌藥物液制備

        酮康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、克霉唑、伊曲康唑、制霉菌素、益康唑和咪康唑購(gòu)自某生物試劑公司,純度均在98%以上。除氟康唑和5-氟胞嘧啶溶于無(wú)菌蒸餾水,其余藥物均溶于DMSO。藥物的測(cè)試濃度范圍:兩性霉素B、克霉唑、伊曲康唑、益康唑、咪康唑?yàn)?.0313~16 μg/mL,酮康唑、制霉菌素、氟康唑、5-氟胞嘧啶為0.125~64 μg/mL。

        1.2.6.2 孢子液制備

        制備方法同1.2.4,用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋至1~5×105個(gè)/mL,置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.7 致病菌生理特性實(shí)驗(yàn)

        按照Hussein等[17]的方法用無(wú)菌打孔器制備6 mm的菌餅,放于PDA平板中央,分別于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng),每組3個(gè)重復(fù);用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)PDA的pH為4.32、5.73、6.86、7.85、8.91、9.72、10.58、11.44,將菌餅分別放于上述平板中央,25 ℃培養(yǎng),每組3個(gè)重復(fù);將菌餅分別放于含NaCl濃度為0%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10%的PDA平板中央,25 ℃培養(yǎng),每組3個(gè)重復(fù)。均在4 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

        2 結(jié)果

        2.1 致病菌的形態(tài)觀察

        從加州鱸患病部位分離純化得到一株真菌,命名MY1。在PDA上培養(yǎng)4~5d鋪滿平板,菌落正面白色,有發(fā)達(dá)的白色棉絮狀氣生菌絲(圖1A);在CMA上生長(zhǎng)特征與PDA相似(圖1B);在SDA上,產(chǎn)黃色色素,菌落背面及培養(yǎng)基由黃色變?yōu)辄S褐色,其他特征與PDA相似(圖1C、1D)。

        圖1 MY1菌落形態(tài)

        在顯微鏡下觀察到菌絲體彎曲,具分枝,部分有分隔(圖2A);小分生孢子卵圓形或橢圓形,0~1個(gè)分隔,大小約為13.6~31.8 μm×2.8~3.9μm(圖2A箭頭指出);大分生孢子鐮刀型,兩端較鈍,頂端稍彎,多數(shù)為3個(gè)分隔,大小約為62.3~113.7 μm×3.5~6.2 μm(圖2B)。

        圖2 MY1菌絲及分生孢子

        2.2 致病菌rDNA-ITS序列分析

        采用真菌通用引物ITS1、ITS4,以純化MY1的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在500~750bp之間有明顯的擴(kuò)增條帶(圖3)。菌株MY1的ITS序列長(zhǎng)度為548 bp,在GenBank上的登錄號(hào)為:MN625846。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),與Fusariumsolani的相似性高達(dá)99%以上。通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果進(jìn)一步表明,MY1與腐皮鐮刀菌(F.solani)(KT876546.1)的同源關(guān)系最近(圖4)。結(jié)合形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果,斷定MY1為腐皮鐮刀菌(F.solani)。

        圖3 rDNA-ITS通用引物對(duì)菌株MY1進(jìn)行PCR結(jié)果

        圖4 基于rDNA-ITS序列的菌株MY1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

        2.3 致病菌的人工感染實(shí)驗(yàn)

        腹腔注射實(shí)驗(yàn)組魚(yú)腹部和肛周充血發(fā)炎(圖5A);尾鰭發(fā)黑,有缺失現(xiàn)象(圖5B);體表有脫鱗現(xiàn)象。進(jìn)一步解剖發(fā)現(xiàn),肝臟、腸出血,脾臟發(fā)黑腫大(圖5C)。在第3 d出現(xiàn)感染和死亡,第6 d感染率100%,第9 d死亡率為100%。創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)組感染魚(yú)體表有菌絲附著(圖5D),第3 d出現(xiàn)感染,第4 d開(kāi)始死亡,第7 d感染率100%,第11 d死亡率為100%。而兩組對(duì)照組均一切正常。從瀕死加州鱸上分離純化得到的菌株,其形態(tài)特征和rDNA-ITS序列與MY1一致??梢耘卸ǜょ牭毒鸀榧又蓣|的一種致病菌。

        圖5 實(shí)驗(yàn)組加州鱸發(fā)病癥狀

        2.4 不同濃度孢子液人工感染實(shí)驗(yàn)

        統(tǒng)計(jì)14 d實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),腹腔注射不同濃度的孢子液,死亡率明顯不同(表1)。除對(duì)照組外,各濃度組均有死亡現(xiàn)象。死亡率隨孢子液濃度升高而增加,其中T1和T2組死亡率較低,且均低于20%;剩余濃度組死亡率均超過(guò)50%,T5和T6組死亡率100%。根據(jù)Probit法計(jì)算,MY1對(duì)加州鱸的LD50為1.03×104個(gè)/mL。

        表1 腹腔注射不同濃度組死亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果

        2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.5.1 藥物初篩

        采用微量液體稀釋法以藥物最高測(cè)試濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MY1在含有兩性霉素B(16 μg/mL)、克霉唑(16 μg/mL)、益康唑(16 μg/mL)和制霉菌素(64 μg/mL)的孔中生長(zhǎng)被抑制;在氟康唑(64 μg/mL)、酮康唑(64 μg/mL)、咪康唑(16 μg/mL)、伊曲康唑(16 μg/mL)和5-氟胞嘧啶(64 μg/mL)的孔中正常生長(zhǎng)。因此選兩性霉素B、克霉唑、益康唑和制霉菌素進(jìn)行后續(xù)藥敏實(shí)驗(yàn)。

        2.5.2 藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        本實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株MIC值均在參考范圍之內(nèi)。

        采用微量液體稀釋法和瓊脂稀釋法測(cè)定4種藥物對(duì)腐皮鐮刀菌的MIC值(表2)??嗣惯?、益康唑和制霉菌素兩種方法結(jié)果一致,MIC分別為16 μg/mL、8 μg/mL和32 μg/mL;兩性霉素B微量液體稀釋法MIC為8 μg/mL,瓊脂稀釋法MIC為16 μg/mL。

        表2 藥敏結(jié)果

        2.6 生理特性

        2.6.1 溫度對(duì)MY1菌生長(zhǎng)的影響

        如表3,菌MY1在10 ~35 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng);在5 ℃和40 ℃時(shí),不生長(zhǎng);25 ~30 ℃生長(zhǎng)最快;10 ℃時(shí)生長(zhǎng)最慢。因此,菌MY1最適生長(zhǎng)溫度為25~30 ℃。

        表3 溫度對(duì)菌MY1生長(zhǎng)的影響

        2.6.2 pH值對(duì)菌MY1生長(zhǎng)的影響

        如表4,菌MY1在pH4.32~11.44時(shí)均可生長(zhǎng);隨著pH值增加,菌絲生長(zhǎng)速度先上升后下降,在pH7.85時(shí)生長(zhǎng)最快。因此,菌MY1生長(zhǎng)最適pH為7.85。

        表4 pH值對(duì)菌MY1生長(zhǎng)的影響

        2.6.3 鹽度對(duì)菌MY1生長(zhǎng)的影響

        如表5,MY1在0%~8%范圍內(nèi)可生長(zhǎng),但隨著培養(yǎng)基中NaCl含量增加,生長(zhǎng)速度顯著下降(P<0.05),當(dāng)NaCl10%時(shí),停止生長(zhǎng)。

        3 討論

        3.1 腐皮鐮刀菌的致病性

        鐮刀菌種類(lèi)繁多,至今已報(bào)道超過(guò)500種,是植物常見(jiàn)致病菌,也可感染人類(lèi)及動(dòng)物,具有致病范圍廣和致病力強(qiáng)等特點(diǎn)[18]。腐皮鐮刀菌可引起凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)黑鰓病[19]、綠海龜(Cheloniamydas)背甲壞死病[20]、海馬(Hippocampuserectus)皮膚壞死和潰爛[21],也會(huì)感染斑馬魚(yú)(Daniorerio)[22]和黑斑條尾魟(Taeniuramelanopsila)[23],致死率較高。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)導(dǎo)致斑馬魚(yú)[24]、羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)[25]、真鯛[11]等死亡。本研究中,發(fā)病加州鱸的癥狀,與已報(bào)道的加州鱸[7]、真鯛[11]等魚(yú)類(lèi)感染鐮刀菌的癥狀相似,從患病部位分離純化到一株優(yōu)勢(shì)菌MY1,通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和rDNA-ITS序列同源比對(duì)及聚類(lèi)分析,確定為腐皮鐮刀菌。人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該菌對(duì)加州鱸有較強(qiáng)的致病力。鐮刀菌孢子濃度的增加,死亡率隨之增加,說(shuō)明當(dāng)孢子達(dá)到一定數(shù)量時(shí),鐮刀菌病便會(huì)爆發(fā)。此外,黃文芳等[13]和可小麗等[14]研究發(fā)現(xiàn),鐮刀菌侵染魚(yú)體與體表?yè)p傷或不良的養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)。因此,減少水產(chǎn)動(dòng)物的機(jī)械損傷,凈化養(yǎng)殖水體,或采用防治藥物,降低水中的孢子濃度,抑制鐮刀菌的生長(zhǎng),能減少鐮刀菌病的發(fā)生。

        3.2 腐皮鐮刀菌耐藥性

        本研究選取了幾種常見(jiàn)的抗真菌藥物對(duì)腐皮鐮刀菌進(jìn)行體外藥效試驗(yàn),結(jié)果顯示,該菌對(duì)兩性霉素B、克霉唑、益康唑、制霉菌素4種藥物敏感。與林嘉銘等[19]、龐溦等[20]研究結(jié)果不完全一致,究其原因可能與菌株不同環(huán)境、不同生理特性等因素有關(guān)。另外,除兩性霉素B瓊脂稀釋法MIC值比微量液體稀釋法高,其余藥物兩種方法結(jié)果一致,可能是由于兩性霉素B對(duì)溫度敏感,導(dǎo)致藥效部分失效。張世奇[16]篩選抗水霉藥物也發(fā)現(xiàn)瓊脂稀釋法MIC值較高。

        3.3 腐皮鐮刀菌生理特性

        通過(guò)生理特性研究發(fā)現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)分離到的腐皮鐮刀菌,對(duì)溫度、pH有較廣的耐受范圍,且最適生長(zhǎng)溫度與加州鱸最適溫度一致,表明在魚(yú)任何生長(zhǎng)時(shí)段,都有感染該菌的可能性。黃文芳等[7]、張艷珍等[12]研究也發(fā)現(xiàn)鐮刀菌病原菌的適應(yīng)性較強(qiáng),能夠很好地適應(yīng)水環(huán)境。氯化鈉在生產(chǎn)上用于魚(yú)類(lèi)真菌病的防治,本研究發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基中氯化鈉含量的增加,腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)速度顯著下降,甚至生長(zhǎng)被完全抑制。

        4 結(jié)論

        本研究從加州鱸患病部位分離純化得到一株強(qiáng)致病性腐皮鐮刀菌,在10~35 ℃和pH 4.32~11.44時(shí)均可生長(zhǎng),氯化鈉、兩性霉素B、克霉唑、益康唑、制霉菌素對(duì)其有抑菌效果。

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